الزائمر کی بیماری (AD) میں پروٹین بائیو مارکر کی کمی ہے جو اس کی متعدد بنیادی پیتھوفیسولوجی کی عکاسی کرتی ہے، جو تشخیص اور علاج کی پیشرفت میں رکاوٹ ہے۔ یہاں، ہم دماغی اسپائنل فلوڈ (CSF) بائیو مارکر کی شناخت کے لیے جامع پروٹومکس استعمال کرتے ہیں جو AD پیتھوفیسولوجی کی ایک وسیع رینج کی نمائندگی کرتے ہیں۔ ملٹی پلیکس ماس سپیکٹومیٹری نے AD CSF اور دماغ میں بالترتیب تقریباً 3,500 اور تقریباً 12,000 پروٹینوں کی نشاندہی کی۔ دماغی پروٹوم کے نیٹ ورک کے تجزیے نے 44 بائیو ڈائیورسٹی ماڈیولز کو حل کیا، جن میں سے 15 دماغی اسپائنل فلوڈ پروٹوم کے ساتھ اوورلیپ ہوئے۔ ان اوور لیپنگ ماڈیولز میں CSF AD مارکر کو پانچ پروٹین گروپس میں جوڑ دیا گیا ہے، جو مختلف پیتھوفزیولوجیکل عمل کی نمائندگی کرتے ہیں۔ AD دماغ میں Synapses اور میٹابولائٹس کم ہو جاتے ہیں، لیکن CSF میں اضافہ ہوتا ہے، جبکہ دماغ اور CSF میں گلیل سے بھرپور مائیلینیشن اور مدافعتی گروپ میں اضافہ ہوتا ہے۔ پینل کی تبدیلیوں کی مستقل مزاجی اور بیماری کی خصوصیت کی تصدیق 500 سے زیادہ اضافی CSF نمونوں میں ہوئی۔ ان گروہوں نے غیر علامتی AD میں حیاتیاتی ذیلی گروپوں کی بھی نشاندہی کی۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج AD میں کلینیکل ایپلی کیشنز کے لیے ویب پر مبنی بائیو مارکر ٹولز کی جانب ایک امید افزا قدم ہیں۔
الزائمر کی بیماری (AD) دنیا بھر میں نیوروڈیجینریٹیو ڈیمنشیا کی سب سے عام وجہ ہے اور اس کی خصوصیت حیاتیاتی نظام کی خرابی کی ایک وسیع رینج سے ہے، بشمول Synaptic ٹرانسمیشن، glial-mediated immunity، اور mitochondrial metabolism (1-3)۔ تاہم، اس کے قائم کردہ پروٹین بائیو مارکر اب بھی امائلائیڈ اور ٹاؤ پروٹین کا پتہ لگانے پر توجہ مرکوز کرتے ہیں، اور اس لیے اس متنوع پیتھوفیسولوجی کی عکاسی نہیں کر سکتے۔ یہ "بنیادی" پروٹین بائیو مارکر جو دماغی اسپائنل فلوئڈ (CSF) میں سب سے زیادہ قابل اعتماد طریقے سے ماپا جاتا ہے ان میں شامل ہیں (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42)، جو cortical amyloid plaques کی تشکیل کو ظاہر کرتا ہے۔ (ii) کل تاؤ، محور کی تنزلی کی علامت؛ (iii) فاسفو ٹاؤ (p-tau)، پیتھولوجیکل تاؤ ہائپر فاسفوریلیشن کا نمائندہ (4-7)۔ اگرچہ ان دماغی اسپائنل فلوئڈ بائیو مارکر نے ہماری "نشان زد" AD پروٹین کی بیماریوں (4-7) کا پتہ لگانے میں بہت سہولت فراہم کی ہے، لیکن وہ بیماری کے پیچھے پیچیدہ حیاتیات کے صرف ایک چھوٹے سے حصے کی نمائندگی کرتے ہیں۔
AD بائیو مارکرز کے پیتھو فزیوولوجیکل تنوع کی کمی نے بہت سے چیلنجوں کو جنم دیا ہے، بشمول (i) AD مریضوں کی حیاتیاتی نسبت کی شناخت اور مقدار درست کرنے میں ناکامی، (ii) بیماری کی شدت اور بڑھنے کی ناکافی پیمائش، خاص طور پر طبی مرحلے میں، اور ( iii) علاج کی دوائیوں کی ترقی جو اعصابی بگاڑ کے تمام پہلوؤں کو مکمل طور پر حل کرنے میں ناکام رہی۔ متعلقہ بیماریوں سے AD کو بیان کرنے کے لیے تاریخی پیتھالوجی پر ہمارا انحصار صرف ان مسائل کو بڑھاتا ہے۔ زیادہ سے زیادہ شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ ڈیمنشیا میں مبتلا زیادہ تر بزرگ افراد میں علمی زوال کی ایک سے زیادہ پیتھولوجیکل خصوصیت ہوتی ہے (8)۔ AD پیتھالوجی والے 90% یا اس سے زیادہ افراد کو بھی عروقی بیماری، TDP-43 شمولیت، یا دیگر تنزلی کی بیماریاں ہوتی ہیں (9)۔ پیتھولوجیکل اوورلیپ کے ان اعلیٰ تناسب نے ڈیمنشیا کے لیے ہمارے موجودہ تشخیصی فریم ورک میں خلل ڈالا ہے، اور اس بیماری کی مزید جامع پیتھو فزیولوجیکل تعریف کی ضرورت ہے۔
مختلف قسم کے AD بائیو مارکروں کی فوری ضرورت کے پیش نظر، فیلڈ بائیو مارکرز کو دریافت کرنے کے لیے مجموعی نظام پر مبنی "اومکس" طریقہ کو تیزی سے اپنا رہا ہے۔ Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD الائنس 2014 میں شروع کیا گیا تھا اور اس پروگرام میں سب سے آگے ہے۔ نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، اکیڈمیا، اور انڈسٹری کی اس کثیر الجہتی کوشش کا مقصد AD کی پیتھوفیسولوجی کو بہتر طریقے سے بیان کرنے اور حیاتیاتی تنوع کے تشخیصی تجزیہ اور علاج کی حکمت عملیوں کو تیار کرنے کے لیے نظام پر مبنی حکمت عملیوں کا استعمال کرنا ہے (10)۔ اس پروجیکٹ کے حصے کے طور پر، نیٹ ورک پروٹومکس AD میں سسٹم پر مبنی بائیو مارکر کی ترقی کے لیے ایک امید افزا ٹول بن گیا ہے۔ ڈیٹا پر مبنی یہ غیرجانبدارانہ نقطہ نظر پیچیدہ پروٹومکس ڈیٹا سیٹس کو گروپس یا شریک اظہار شدہ پروٹینوں کے "ماڈیولز" میں ترتیب دیتا ہے جو مخصوص سیل کی اقسام، آرگنیلز، اور حیاتیاتی افعال (11-13) سے وابستہ ہوتے ہیں۔ تقریباً 12 معلومات سے بھرپور نیٹ ورک پروٹومکس اسٹڈیز AD دماغ (13-23) پر کی گئی ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ تجزیے اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ AD دماغی نیٹ ورک پروٹوم آزاد گروہوں اور متعدد کارٹیکل خطوں میں ایک انتہائی محفوظ ماڈیولر تنظیم کو برقرار رکھتا ہے۔ اس کے علاوہ، ان میں سے کچھ ماڈیول ڈیٹا سیٹس میں AD سے متعلقہ کثرت میں تولیدی تبدیلیاں دکھاتے ہیں، جو متعدد بیماریوں کی پیتھوفیسولوجی کی عکاسی کرتے ہیں۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج AD میں سسٹم پر مبنی بائیو مارکر کے طور پر دماغی نیٹ ورک پروٹوم کی دریافت کے لیے ایک امید افزا اینکر پوائنٹ کا مظاہرہ کرتے ہیں۔
AD برین نیٹ ورک پروٹوم کو طبی لحاظ سے مفید سسٹم پر مبنی بائیو مارکر میں تبدیل کرنے کے لیے، ہم نے دماغ سے ماخوذ نیٹ ورک کو AD CSF کے پروٹومک تجزیہ کے ساتھ جوڑ دیا۔ اس مربوط نقطہ نظر کی وجہ سے CSF بائیو مارکرز کے پانچ امید افزا سیٹوں کی شناخت ہوئی جو دماغ پر مبنی پیتھوفیسولوجی کی ایک وسیع رینج سے وابستہ ہیں، بشمول Synapses، خون کی نالیوں، مائیلینیشن، سوزش، اور میٹابولک راستوں کی ناکارہی۔ ہم نے ان بائیو مارکر پینلز کی متعدد نقل کے تجزیوں کے ذریعے کامیابی کے ساتھ توثیق کی، بشمول مختلف نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے 500 سے زیادہ CSF نمونے۔ ان توثیق کے تجزیوں میں غیر علامتی AD (AsymAD) والے مریضوں کے CSF میں گروپ کے اہداف کی جانچ کرنا یا عام علمی ماحول میں غیر معمولی امائلائیڈ جمع ہونے کا ثبوت دکھانا شامل ہے۔ یہ تجزیے AsymAD آبادی میں اہم حیاتیاتی متفاوت کو اجاگر کرتے ہیں اور پینل مارکر کی نشاندہی کرتے ہیں جو بیماری کے ابتدائی مراحل میں افراد کو ذیلی ٹائپ کرنے کے قابل ہو سکتے ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج متعدد سسٹمز پر مبنی پروٹین بائیو مارکر ٹولز کی ترقی میں ایک اہم قدم کی نمائندگی کرتے ہیں جو AD کو درپیش بہت سے طبی چیلنجوں کو کامیابی سے حل کر سکتے ہیں۔
اس مطالعے کا بنیادی مقصد نئے دماغی اسپائنل فلوڈ بائیو مارکرز کی نشاندہی کرنا ہے جو دماغ پر مبنی مختلف پیتھوفیسولوجی کی عکاسی کرتے ہیں جو AD کی طرف لے جاتے ہیں۔ شکل S1 ہمارے تحقیقی طریقہ کار کا خاکہ پیش کرتا ہے، جس میں (i) ایک جامع تجزیہ شامل ہے جو AD CSF کے ابتدائی نتائج اور نیٹ ورک برین پروٹوم کے ذریعے دماغ سے متعلقہ CSF بیماری کے بائیو مارکرز کی نشاندہی کرتا ہے، اور (ii) اس کے بعد کی نقل یہ بائیو مارکر کئی آزاد دماغی خلیوں میں ہیں۔ سیال گروہ. دریافت پر مبنی تحقیق ایموری گوزیوٹا الزائمر ڈیزیز ریسرچ سینٹر (ADRC) میں 20 علمی طور پر نارمل افراد اور 20 AD مریضوں میں CSF کے امتیازی اظہار کے تجزیہ کے ساتھ شروع ہوئی۔ AD کی تشخیص کو دماغی اسپائنل فلوئڈ میں کم Aβ1-42 اور کل tau اور p-tau کی بلند سطحوں کی موجودگی میں ایک اہم علمی خرابی کے طور پر بیان کیا گیا ہے [میین مونٹریال کوگنیٹو اسیسمنٹ (MoCA)، 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (ٹیبل S1A)۔ کنٹرول (مطلب MoCA، 26.7 ± 2.2) میں CSF بائیو مارکر کی عام سطح تھی۔
انسانی CSF پروٹین کی کثرت کی ایک متحرک رینج کی طرف سے خصوصیات ہے، جس میں البومین اور دیگر انتہائی پرچر پروٹین دلچسپی کے پروٹین کی کھوج کو روک سکتے ہیں (24)۔ پروٹین کی دریافت کی گہرائی کو بڑھانے کے لیے، ہم نے ماس اسپیکٹومیٹری (MS) تجزیہ (24) سے پہلے ہر CSF نمونے سے پہلے 14 انتہائی وافر پروٹینز کو ہٹا دیا۔ ایم ایس کے ذریعہ کل 39,805 پیپٹائڈس کی شناخت کی گئی تھی، جنہیں 40 نمونوں میں 3691 پروٹومس پر نقشہ بنایا گیا تھا۔ پروٹین کی مقدار کا تعین ایک سے زیادہ ٹینڈم ماس ٹیگ (ٹی ایم ٹی) لیبلنگ (18، 25) کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ گمشدہ اعداد و شمار کو حل کرنے کے لیے، ہم نے صرف وہی پروٹین شامل کیے جو بعد کے تجزیے میں کم از کم 50% نمونوں میں مقدار کے مطابق تھے، اس طرح آخر کار 2875 پروٹوم کی مقدار درست ہو گئی۔ کل پروٹین کی کثرت کی سطح میں نمایاں فرق کی وجہ سے، ایک کنٹرول نمونے کو شماریاتی طور پر آؤٹ لیئر (13) سمجھا جاتا تھا اور اسے بعد کے تجزیے میں شامل نہیں کیا گیا تھا۔ بقیہ 39 نمونوں کی کثرت کی قدروں کو عمر، جنس، اور بیچ ہم آہنگی (13-15، 17، 18، 20، 26) کے مطابق ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔
ریگریشن ڈیٹا سیٹ پر تفریق اظہار کا اندازہ کرنے کے لیے شماریاتی t-ٹیسٹ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے، اس تجزیے نے ان پروٹینوں کی نشاندہی کی جن کی کثرت کی سطح کو کنٹرول اور AD کیسز (ٹیبل S2A) کے درمیان نمایاں طور پر تبدیل کیا گیا تھا (P <0.05)۔ جیسا کہ شکل 1A میں دکھایا گیا ہے، AD میں کل 225 پروٹینوں کی کثرت نمایاں طور پر کم ہوئی تھی، اور 303 پروٹینوں کی کثرت میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ ان امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے پروٹینوں میں پہلے سے شناخت شدہ دماغی اسپائنل فلوئیڈ AD مارکر شامل ہیں، جیسے مائکروٹوبول سے وابستہ پروٹین ٹاؤ (MAPT؛ P = 3.52 × 10−8)، نیوروفیلامنٹ (NEFL؛ P = 6.56 × 10−3)، نمو سے متعلق پروٹین 43۔ (GAP43; P = 1.46 × 10−5)، فیٹی ایسڈ بائنڈنگ پروٹین 3 (FABP3؛ P = 2.00 × 10−5)، Chitinase 3 جیسے 1 (CHI3L1؛ P = 4.44 × 10−6)، نیورل گرینولن (NRGN; P = 3.43 × 10−4) اور VGF اعصاب کی نشوونما کا عنصر (VGF؛ P = 4.83 × 10−3) (4-6)۔ تاہم، ہم نے دوسرے بہت اہم اہداف کی بھی نشاندہی کی، جیسے کہ GDP dissociation inhibitor 1 (GDI1؛ P = 1.54 × 10-10) اور SPARC سے متعلق ماڈیولر کیلشیم بائنڈنگ 1 (SMOC1؛ P = 6.93 × 10-9)۔ 225 نمایاں طور پر کم پروٹینوں کے جین اونٹولوجی (GO) کے تجزیے سے جسم کے سیال کے عمل جیسے سٹیرایڈ میٹابولزم، خون جمنا، اور ہارمون کی سرگرمی (شکل 1B اور ٹیبل S2B) کے ساتھ قریبی روابط کا انکشاف ہوا۔ اس کے برعکس، 303 کے نمایاں طور پر بڑھے ہوئے پروٹین کا سیل کی ساخت اور توانائی کے تحول سے گہرا تعلق ہے۔
(A) آتش فشاں پلاٹ t-ٹیسٹ کے ذریعہ حاصل کردہ -log10 شماریاتی P قدر (y-axis) کے مقابلہ میں log2 فولڈ تبدیلی (x-axis) دکھاتا ہے، جو کنٹرول (CT) اور کے درمیان تفریق اظہار کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ تمام پروٹینوں کے CSF پروٹوم کے AD کیسز۔ AD میں نمایاں طور پر کم لیول (P <0.05) والے پروٹین نیلے رنگ میں دکھائے گئے ہیں، جبکہ بیماری میں نمایاں طور پر بڑھی ہوئی سطح والے پروٹین سرخ رنگ میں دکھائے گئے ہیں۔ منتخب پروٹین پر لیبل لگا ہوا ہے۔ (B) پروٹین سے متعلق سرفہرست GO اصطلاحات AD میں نمایاں طور پر کم (نیلے) اور بڑھے ہوئے (سرخ) ہیں۔ حیاتیاتی عمل، مالیکیولر فنکشنز، اور سیلولر اجزاء کے شعبوں میں سب سے زیادہ زیڈ اسکور کے ساتھ تین GO اصطلاحات دکھاتا ہے۔ (C) MS نے CSF نمونے (بائیں) میں MAPT کی سطح کی پیمائش کی اور نمونہ ELISA tau سطح (دائیں) کے ساتھ اس کا ارتباط۔ متعلقہ P قدر کے ساتھ Pearson کے ارتباط کا گتانک ظاہر ہوتا ہے۔ ایک AD کیس کے لیے ELISA ڈیٹا کی کمی کی وجہ سے، ان اعداد و شمار میں تجزیہ کیے گئے 39 میں سے 38 کی قدریں شامل ہیں۔ (D) زیر نگرانی کلسٹر تجزیہ (P <0.0001، Benjamini-Hochberg (BH) P <0.01 کو ایڈجسٹ کیا گیا) کنٹرول پر اور AD CSF نے ڈیٹا سیٹ میں 65 نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے نمونے پائے۔ معیاری بنانا، معمول بنانا۔
MAPT کا پروٹومک لیول آزادانہ طور پر ماپا جانے والے ELISA tau لیول (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figure 1C) سے قریبی تعلق رکھتا ہے، جو ہماری MS پیمائش کی درستگی کی حمایت کرتا ہے۔ amyloid precursor پروٹین (APP) کی سطح پر ٹرپسن ہضم ہونے کے بعد، Aβ1-40 اور Aβ1-42 کے C-ٹرمینس میں نقشہ کردہ isoform-specific peptides کو مؤثر طریقے سے ionized نہیں کیا جا سکتا (27, 28)۔ لہذا، ہم نے جن APP پیپٹائڈس کی نشاندہی کی ہے ان کا ELISA Aβ1-42 کی سطحوں سے کوئی تعلق نہیں ہے۔ ہر معاملے کے تفریق اظہار کا اندازہ کرنے کے لیے، ہم نے نمونوں (ٹیبل S2A) کے زیر نگرانی کلسٹر تجزیہ کرنے کے لیے P <0.0001 [غلط دریافت کی شرح (FDR) درست P <0.01] کے ساتھ تفریق شدہ پروٹین کا استعمال کیا۔ جیسا کہ شکل 1D میں دکھایا گیا ہے، یہ 65 انتہائی اہم پروٹین بیماری کی حالت کے مطابق نمونوں کو صحیح طریقے سے کلسٹر کر سکتے ہیں، سوائے کنٹرول جیسی خصوصیات کے ساتھ ایک AD کیس کے۔ ان 65 پروٹینوں میں سے، 63 میں AD میں اضافہ ہوا، جب کہ صرف دو (CD74 اور ISLR) کم ہوئے۔ مجموعی طور پر، دماغی اسپائنل فلوئڈ کے ان تجزیوں نے AD میں سینکڑوں پروٹینوں کی نشاندہی کی ہے جو بیماری کے بائیو مارکر کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔
پھر ہم نے AD دماغ پروٹوم کا ایک آزاد نیٹ ورک تجزیہ کیا۔ اس دریافت کے دماغی گروہ میں کنٹرول (n = 10) سے ڈورسولیٹرل پریفرنٹل کورٹیکس (DLPFC)، پارکنسنز کی بیماری (PD؛ n = 10)، مخلوط AD/PD (n = 10) اور AD (n = 10) کیسز شامل تھے۔ ) نمونہ۔ Emery Goizueta ADRC۔ ان 40 کیسز کی ڈیموگرافکس پہلے بیان کی جا چکی ہیں (25) اور ان کا خلاصہ ٹیبل S1B میں دیا گیا ہے۔ ہم نے TMT-MS کا استعمال دماغ کے ان 40 ٹشوز اور 27 کیسوں کی نقل تیار کرنے کے لیے کیا۔ مجموعی طور پر، ان دو دماغی ڈیٹا سیٹوں نے 227،121 منفرد پیپٹائڈس تیار کیے، جن کو 12،943 پروٹوم (25) پر نقشہ بنایا گیا۔ صرف وہی پروٹین جو کم از کم 50% کیسوں میں مقدار کے مطابق تھے بعد کی تحقیقات میں شامل کیے گئے۔ حتمی دریافت ڈیٹا سیٹ میں 8817 مقداری پروٹین شامل ہیں۔ عمر، جنس، اور پوسٹ مارٹم وقفہ (PMI) کی بنیاد پر پروٹین کی کثرت کی سطح کو ایڈجسٹ کریں۔ رجعت کے بعد سیٹ کیے گئے ڈیٹا کے امتیازی اظہار کے تجزیے سے ظاہر ہوا کہ > 2000 پروٹین کی سطحیں دو یا دو سے زیادہ بیماریوں کے گروہوں میں [P <0.05، تغیر کا تجزیہ (ANOVA)] نمایاں طور پر تبدیل کی گئیں۔ اس کے بعد، ہم نے تفریق شدہ پروٹینز، اور P <0.0001 AD/control اور/یا AD/PD موازنہ (شکل S2، A اور B، Table S2C) کی بنیاد پر ایک زیر نگرانی کلسٹر تجزیہ کیا۔ یہ 165 انتہائی تبدیل شدہ پروٹین کنٹرول اور PD نمونوں سے AD پیتھالوجی کے معاملات کو واضح طور پر پیش کرتے ہیں، جو پورے پروٹوم میں مضبوط AD مخصوص تبدیلیوں کی تصدیق کرتے ہیں۔
اس کے بعد ہم نے دریافت شدہ دماغی پروٹوم پر نیٹ ورک تجزیہ کرنے کے لیے Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) نامی ایک الگورتھم کا استعمال کیا، جو اسی طرح کے اظہار کے پیٹرن (11-13) کے ساتھ پروٹین ماڈیولز میں سیٹ ڈیٹا کو منظم کرتا ہے۔ تجزیہ نے 44 ماڈیولز (M) مشترکہ اظہار شدہ پروٹینوں کی نشاندہی کی، جو سب سے بڑے (M1, n = 1821 پروٹین) سے چھوٹے (M44, n = 34 پروٹینز) (شکل 2A اور ٹیبل S2D) تک ترتیب دیئے گئے اور شمار کیے گئے۔ جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے (13) ہر ماڈیول کے نمائندہ اظہار پروفائل یا خصوصیت والے پروٹین کا حساب لگائیں، اور اسے بیماری کی حالت اور AD پیتھالوجی کے ساتھ جوڑیں، یعنی الزائمر ڈیزیز رجسٹری (CERAD) اور بریک سکور (Figure 2B) کا اتحاد قائم کریں۔ مجموعی طور پر، 17 ماڈیولز نمایاں طور پر AD نیوروپیتھولوجی (P <0.05) سے متعلق تھے۔ ان میں سے بہت سے بیماری سے متعلق ماڈیولز سیل کی قسم کے مخصوص مارکر (شکل 2B) سے بھی بھرپور ہیں۔ جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے (13)، سیل کی قسم کی افزودگی کا تعین ماڈیول اوورلیپ اور سیل ٹائپ مخصوص جینز کی حوالہ فہرست کا تجزیہ کرکے کیا جاتا ہے۔ یہ جین الگ تھلگ ماؤس نیورونز، اینڈوتھیلیل اور گلیل سیلز میں شائع شدہ ڈیٹا سے اخذ کیے گئے ہیں۔ آر این اے سیکوینسنگ (RNA-seq) تجربہ (29)۔
(A) دماغ پروٹوم کا WGCNA دریافت کریں۔ (B) AD نیوروپیتھولوجیکل خصوصیات (اوپر) کے ساتھ ماڈیولر سگنیچر پروٹین (ماڈیولر پروٹین ایکسپریشن کا پہلا بڑا جزو) کا بائی ویٹ مڈ کورلیشن (BiCor) تجزیہ، بشمول CERAD (Aβ تختی) اور براک (تاؤ ٹینگلز) اسکورز۔ مثبت (سرخ) اور منفی (نیلے) ارتباط کی شدت کو دو رنگوں کے گرمی کے نقشے سے دکھایا گیا ہے، اور ستارے شماریاتی اہمیت کی نشاندہی کرتے ہیں (P <0.05)۔ Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (نیچے) کا استعمال ہر پروٹین ماڈیول کے سیل ٹائپ ایسوسی ایشن کا اندازہ کرنے کے لیے کریں۔ سرخ شیڈنگ کی شدت سیل کی قسم کی افزودگی کی ڈگری کی نشاندہی کرتی ہے، اور ستارہ شماریاتی اہمیت کی نشاندہی کرتا ہے (P <0.05)۔ FET سے حاصل کردہ P قدر کو درست کرنے کے لیے BH طریقہ استعمال کریں۔ (C) ماڈیولر پروٹین کا GO تجزیہ۔ ہر ماڈیول یا متعلقہ ماڈیول گروپ کے لیے سب سے زیادہ قریب سے متعلقہ حیاتیاتی عمل دکھائے گئے ہیں۔ oligo، oligodendrocyte.
پانچ قریب سے متعلقہ آسٹروکائٹ اور مائکروگلیہ سے بھرپور ماڈیولز (M30, M29, M18, M24, اور M5) کے ایک سیٹ نے AD نیوروپیتھولوجی (شکل 2B) کے ساتھ ایک مضبوط مثبت تعلق ظاہر کیا۔ آنٹولوجی تجزیہ ان گلیل ماڈیولز کو سیل کی نشوونما، پھیلاؤ اور قوت مدافعت سے جوڑتا ہے (شکل 2C اور ٹیبل S2E)۔ دو اضافی گلیل ماڈیولز، M8 اور M22، بھی بیماری میں مضبوطی سے اپ گریگولیٹ ہوتے ہیں۔ M8 کا تعلق ٹول نما رسیپٹر پاتھ وے سے ہے، ایک سگنلنگ جھرن جو پیدائشی مدافعتی ردعمل میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے (30)۔ ایک ہی وقت میں، M22 کا مترجم کے بعد کی ترمیم سے گہرا تعلق ہے۔ M2، جو اولیگوڈینڈروسائٹس سے مالا مال ہے، AD پیتھالوجی کے ساتھ ایک مضبوط مثبت تعلق اور نیوکلیوسائیڈ ترکیب اور DNA نقل کے ساتھ ایک آنٹولوجیکل تعلق ظاہر کرتا ہے، جو بیماریوں میں سیل کے بڑھے ہوئے پھیلاؤ کی نشاندہی کرتا ہے۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج گلیل ماڈیولز کی بلندی کی حمایت کرتے ہیں جو ہم نے پہلے AD نیٹ ورک پروٹوم (13، 17) میں دیکھے ہیں۔ فی الحال یہ پایا گیا ہے کہ نیٹ ورک میں بہت سے AD سے متعلق گلیل ماڈیولز کنٹرول اور PD کیسز میں اظہار کی کم سطح دکھاتے ہیں، ان کی بیماری کی خصوصیت کو اجاگر کرتے ہیں جو AD (فگر S2C) میں بلند ہے۔
ہمارے نیٹ ورک پروٹوم (M1، M3، M10، اور M32) میں صرف چار ماڈیولز AD پیتھالوجی (P <0.05) (شکل 2، B اور C) کے ساتھ سختی سے منفی طور پر منسلک ہیں۔ M1 اور M3 دونوں نیورونل مارکر سے بھرپور ہیں۔ M1 Synaptic سگنلز سے بہت زیادہ تعلق رکھتا ہے، جبکہ M3 کا مائٹوکونڈریل فنکشن سے گہرا تعلق ہے۔ M10 اور M32 کے لیے سیل قسم کی افزودگی کا کوئی ثبوت نہیں ہے۔ M32 M3 اور سیل میٹابولزم کے درمیان تعلق کی عکاسی کرتا ہے، جبکہ M10 سیل کی افزائش اور مائیکرو ٹیوبول فنکشن سے بہت زیادہ تعلق رکھتا ہے۔ AD کے مقابلے میں، چاروں ماڈیولز کو کنٹرول اور PD میں بڑھایا جاتا ہے، جس سے انہیں بیماری سے متعلق AD تبدیلیاں (فگر S2C) ملتی ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج نیوران سے بھرپور ماڈیولز کی کثرت میں کمی کی حمایت کرتے ہیں جو ہم نے پہلے AD (13، 17) میں دیکھے ہیں۔ خلاصہ طور پر، دماغ کے پروٹوم کے نیٹ ورک کے تجزیے میں جو ہم نے دریافت کیا ہے اس میں ہمارے پچھلے نتائج کے مطابق AD کے خاص طور پر تبدیل شدہ ماڈیولز تیار کیے گئے ہیں۔
AD ایک ابتدائی اسیمپٹومیٹک مرحلے (AsymAD) کی خصوصیت ہے، جس میں افراد طبی علمی کمی کے بغیر امائلائڈ جمع کی نمائش کرتے ہیں (5, 31)۔ یہ غیر علامتی مرحلہ ابتدائی پتہ لگانے اور مداخلت کے لیے ایک اہم ونڈو کی نمائندگی کرتا ہے۔ ہم نے پہلے آزاد ڈیٹا سیٹس (13، 17) میں AsymAD اور AD دماغی نیٹ ورک پروٹوم کے مضبوط ماڈیولر تحفظ کا مظاہرہ کیا ہے۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ ہم نے فی الحال جو دماغی نیٹ ورک دریافت کیا ہے وہ ان سابقہ نتائج سے مطابقت رکھتا ہے، ہم نے DLPFC کی 27 تنظیموں کے نقل کردہ ڈیٹا سیٹ میں 44 ماڈیولز کے تحفظ کا تجزیہ کیا۔ ان تنظیموں میں کنٹرول (n = 10)، AsymAD (n = 8) اور AD (n = 9) کیسز شامل ہیں۔ ہمارے دریافت دماغی گروہ (ٹیبل S1B) کے تجزیے میں کنٹرول اور AD کے نمونے شامل کیے گئے تھے، جبکہ AsymAD کیسز صرف نقل کرنے والے گروہ میں منفرد تھے۔ یہ AsymAD کیسز Emory Goizueta ADRC برین بینک سے بھی آئے۔ اگرچہ موت کے وقت ادراک عام تھا، امائلائڈ کی سطح غیر معمولی طور پر زیادہ تھی (مطلب CERAD، 2.8 ± 0.5) (ٹیبل S1B)۔
دماغ کے ان 27 ٹشوز کے TMT-MS کے تجزیے کے نتیجے میں 11,244 پروٹیومز کی مقدار درست ہو گئی۔ اس حتمی شمار میں صرف وہ پروٹین شامل ہیں جن کی مقدار کم از کم 50% نمونوں میں ہے۔ اس نقل شدہ ڈیٹا سیٹ میں ہمارے دریافت شدہ دماغی تجزیے میں پائے جانے والے 8817 پروٹینوں میں سے 8638 (98.0%) شامل ہیں، اور کنٹرول اور AD کوہورٹس کے درمیان تقریباً 3000 نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹینز ہیں (P <0.05، تغیر کے تجزیہ کے لیے Tukey کے پیئرڈ ٹی ٹیسٹ کے بعد) ( ٹیبل S2F)۔ ان امتیازی طور پر ظاہر کردہ پروٹینوں میں، 910 نے AD اور دماغی پروٹوم کنٹرول کیسز کے درمیان نمایاں سطح کی تبدیلیاں بھی ظاہر کیں (P <0.05، ANOVA Tukey جوڑا بنانے کے بعد)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ یہ 910 مارکر پروٹوم (r = 0.94، P <1.0 × 10-200) (شکل S3A) کے درمیان تبدیلی کی سمت میں انتہائی مطابقت رکھتے ہیں۔ بڑھے ہوئے پروٹینوں میں، ڈیٹا سیٹ کے درمیان سب سے زیادہ مستقل تبدیلیوں کے ساتھ پروٹین بنیادی طور پر گلیل سے بھرپور M5 اور M18 ماڈیولز (MDK، COL25A1، MAPT، NTN1، SMOC1، اور GFAP) کے ارکان ہیں۔ کم ہونے والے پروٹینوں میں، سب سے زیادہ مستقل تبدیلیوں والے تقریباً خصوصی طور پر M1 ماڈیول (NPTX2، VGF، اور RPH3A) کے ارکان تھے جو Synapse سے وابستہ تھے۔ ہم نے مغربی بلاٹنگ (فگر S3B) کے ذریعہ مڈکائن (MDK)، CD44، سیکریٹڈ فریزڈ سے متعلق پروٹین 1 (SFRP1) اور VGF کی AD سے متعلقہ تبدیلیوں کی مزید تصدیق کی۔ ماڈیول کے تحفظ کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ دماغ کے پروٹوم میں تقریباً 80% پروٹین ماڈیولز (34/44) نقلی ڈیٹا سیٹ (z-score> 1.96، FDR درست P <0.05) (شکل S3C) میں نمایاں طور پر محفوظ تھے۔ ان میں سے چودہ ماڈیول خاص طور پر دو پروٹوم کے درمیان محفوظ کیے گئے تھے (z-score> 10، FDR درست P <1.0 × 10−23)۔ مجموعی طور پر، دماغی پروٹوم کے درمیان امتیازی اظہار اور ماڈیولر ساخت میں اعلی درجے کی مستقل مزاجی کی دریافت اور نقل AD فرنٹل کورٹیکس پروٹین میں تبدیلیوں کی تولیدی صلاحیت کو نمایاں کرتی ہے۔ اس کے علاوہ، اس نے اس بات کی بھی تصدیق کی کہ AsymAD اور زیادہ جدید بیماریوں میں دماغی نیٹ ورک کی ساخت بہت ملتی جلتی ہے۔
دماغی نقل کے ڈیٹا سیٹ میں امتیازی اظہار کا مزید تفصیلی تجزیہ AsymAD پروٹین کی تبدیلیوں کی نمایاں ڈگری کو نمایاں کرتا ہے، بشمول AsymAD اور کنٹرول (P <0.05) (Figure S3D) کے درمیان کل 151 نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین۔ امیلائڈ بوجھ کے مطابق، AsymAD اور AD کے دماغ میں APP نمایاں طور پر بڑھ گئی۔ MAPT صرف AD میں نمایاں طور پر تبدیل ہوتا ہے، جو کہ الجھنے کی بڑھتی ہوئی سطحوں اور علمی زوال کے ساتھ اس کے معروف ارتباط کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے (5, 7)۔ glial سے بھرپور ماڈیول (M5 اور M18) AsymAD میں بڑھے ہوئے پروٹین میں بہت زیادہ جھلکتے ہیں، جبکہ نیورون سے متعلق M1 ماڈیول AsymAD میں کم ہونے والے پروٹین کا سب سے زیادہ نمائندہ ہے۔ ان میں سے بہت سے AsymAD مارکر علامتی بیماریوں میں زیادہ تبدیلیاں ظاہر کرتے ہیں۔ ان مارکروں میں SMOC1، M18 سے تعلق رکھنے والا ایک گلیل پروٹین ہے، جو دماغی رسولیوں اور آنکھوں اور اعضاء کی نشوونما سے وابستہ ہے (32)۔ MDK سیل کی نشوونما اور انجیوجینیسیس (33) سے متعلق ہیپرین بائنڈنگ گروتھ فیکٹر ہے، جو M18 کا ایک اور رکن ہے۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، AsymAD میں نمایاں اضافہ ہوا، جس کے بعد AD میں زیادہ اضافہ ہوا۔ اس کے برعکس، Synaptic پروٹین neuropentraxin 2 (NPTX2) AsymAD دماغ میں نمایاں طور پر کم ہوا تھا۔ این پی ٹی ایکس 2 پہلے نیوروڈیجنریشن سے وابستہ تھا اور اتیجاتی synapses (34) کی ثالثی میں اس کا تسلیم شدہ کردار ہے۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج AD میں متعدد مختلف preclinical پروٹین کی تبدیلیوں کو ظاہر کرتے ہیں جو بیماری کی شدت کے ساتھ ترقی کرتی نظر آتی ہیں۔
یہ دیکھتے ہوئے کہ ہم نے دماغی پروٹوم کی دریافت میں پروٹین کوریج کی ایک اہم گہرائی حاصل کی ہے، ہم نیٹ ورک کی سطح کے AD ٹرانسکروم کے ساتھ اس کے اوورلیپ کو مزید مکمل طور پر سمجھنے کی کوشش کر رہے ہیں۔ لہذا، ہم نے دماغ کے پروٹوم کا موازنہ اس ماڈیول سے کیا جو ہم نے پہلے AD (n = 308) اور کنٹرول (n = 157) DLPFC ٹشوز (13) میں 18,204 جینوں کی مائکرو رے پیمائش سے پیدا کیا تھا۔ اوورلیپنگ مجموعی طور پر، ہم نے 20 مختلف آر این اے ماڈیولز کی نشاندہی کی، جن میں سے بہت سے مخصوص سیل اقسام کی افزودگی کا مظاہرہ کرتے ہیں، بشمول نیوران، اولیگوڈینڈروسائٹس، ایسٹروائٹس، اور مائیکروگلیہ (شکل 3A)۔ AD میں ان ماڈیولز کی متعدد تبدیلیوں کو شکل 3B میں دکھایا گیا ہے۔ گہرے بغیر لیبل والے ایم ایس پروٹوم (تقریباً 3000 پروٹین) (13) کا استعمال کرتے ہوئے ہمارے پچھلے پروٹین-آر این اے اوورلیپ تجزیہ سے مطابقت رکھتے ہوئے، دماغ کے پروٹوم نیٹ ورک کے 44 ماڈیولز میں سے زیادہ تر ٹرانسکرپٹوم نیٹ ورک میں ہیں۔ ہماری دریافت اور ان 34 پروٹین ماڈیولز کی نقل جو دماغی پروٹوم میں انتہائی برقرار ہیں، صرف 14 (~ 40%) نے فشر کے عین مطابق ٹیسٹ (FET) کو پاس کیا، یہ ثابت ہوا کہ ٹرانسکرپٹوم (شکل 3A) کے ساتھ اعداد و شمار کے لحاظ سے اہم اوورلیپ ہے۔ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت (P-M25 اور P-M19)، پروٹین ٹرانسلیشن (P-M7 اور P-M20)، RNA بائنڈنگ/ splicing (P-M16 اور P-M21) اور پروٹین ٹارگٹنگ (P-M13 اور P-) کے ساتھ ہم آہنگ۔ M23) ٹرانسکرپٹوم میں ماڈیولز کے ساتھ اوورلیپ نہیں ہوتا ہے۔ لہذا، اگرچہ موجودہ اوورلیپ تجزیہ (13) میں ایک گہرا پروٹوم ڈیٹا سیٹ استعمال کیا جاتا ہے، لیکن زیادہ تر AD نیٹ ورک پروٹوم کو ٹرانسکرپٹوم نیٹ ورک میں میپ نہیں کیا جاتا ہے۔
(A) ہائپر جیومیٹرک FET AD ٹرانسکرپٹوم (اوپر) کے RNA ماڈیول میں سیل قسم کے مخصوص مارکروں کی افزودگی اور AD دماغ کے RNA (x-axis) اور پروٹین (y-axis) ماڈیولز کے درمیان اوورلیپ کی ڈگری کو ظاہر کرتا ہے۔ (نیچے) سرخ شیڈنگ کی شدت اوپری پینل میں سیل اقسام کی افزودگی کی ڈگری اور نیچے والے پینل میں ماڈیولز کے اوورلیپ کی شدت کی نشاندہی کرتی ہے۔ ستارے شماریاتی اہمیت کی نشاندہی کرتے ہیں (P <0.05)۔ (B) ہر ٹرانسکرپٹوم ماڈیول اور AD کی حیثیت کے خصوصیت والے جین کے مابین ارتباط کی ڈگری۔ بائیں طرف کے ماڈیولز AD (نیلے) کے ساتھ سب سے زیادہ منفی طور پر منسلک ہوتے ہیں، اور دائیں طرف والے سب سے زیادہ مثبت طور پر AD (سرخ) کے ساتھ منسلک ہوتے ہیں۔ لاگ میں تبدیل شدہ BH- درست شدہ P قدر ہر ارتباط کی شماریاتی اہمیت کی ڈگری کو ظاہر کرتی ہے۔ (C) مشترکہ سیل قسم کی افزودگی کے ساتھ نمایاں اوورلیپنگ ماڈیولز۔ (D) اوورلیپنگ ماڈیول میں لیبل لگے ہوئے پروٹین (x-axis) اور RNA (y-axis) کی لاگ 2 فولڈ تبدیلی کا ارتباطی تجزیہ۔ متعلقہ P قدر کے ساتھ Pearson کے ارتباط کا گتانک ظاہر ہوتا ہے۔ مائیکرو، مائیکروگلیا؛ آسمانی اجسام، ایسٹروائٹس۔ سی ٹی، کنٹرول۔
زیادہ تر اوور لیپنگ پروٹین اور آر این اے ماڈیول ایک جیسے سیل قسم کی افزودگی پروفائلز اور AD کی تبدیلی کی مسلسل سمتوں (شکل 3، B اور C) کا اشتراک کرتے ہیں۔ دوسرے لفظوں میں، دماغی پروٹوم (PM1) کے Synapse سے متعلق M1 ماڈیول کو تین نیورونل سے بھرپور ہومولوگس RNA ماڈیولز (R-M1, R-M9 اور R-M16) کے ساتھ میپ کیا گیا ہے، جو کہ AD دونوں میں دکھایا گیا ہے۔ ایک کم سطح. اسی طرح، گلیل سے بھرپور M5 اور M18 پروٹین ماڈیول ایسٹروسائٹس اور مائکروگلیئل مارکر (R-M3، R-M7، اور R-M10) سے بھرپور RNA ماڈیولز کے ساتھ اوورلیپ ہوتے ہیں اور بیماریوں میں اضافے میں بہت زیادہ ملوث ہوتے ہیں۔ دونوں ڈیٹا سیٹوں کے درمیان یہ مشترکہ ماڈیولر خصوصیات سیل کی قسم کی افزودگی اور بیماری سے متعلق تبدیلیوں کی مزید حمایت کرتی ہیں جو ہم نے دماغی پروٹوم میں دیکھی ہیں۔ تاہم، ہم نے ان مشترکہ ماڈیولز میں RNA اور انفرادی مارکر کے پروٹین کی سطح کے درمیان بہت سے اہم فرق دیکھے۔ ان اوور لیپنگ ماڈیولز (شکل 3D) کے اندر موجود مالیکیولز کے پروٹومکس اور ٹرانسکرومکس کے امتیازی اظہار کا ارتباطی تجزیہ اس عدم مطابقت کو نمایاں کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، اے پی پی اور کئی دیگر گلیل ماڈیول پروٹینز (NTN1، MDK، COL25A1، ICAM1، اور SFRP1) نے AD پروٹوم میں نمایاں اضافہ دکھایا، لیکن AD ٹرانسکرپٹوم میں تقریباً کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ پروٹین سے متعلق یہ تبدیلیاں امائلائیڈ تختیوں (23، 35) سے قریبی تعلق رکھتی ہیں، پروٹوم کو پیتھولوجیکل تبدیلیوں کے ماخذ کے طور پر اجاگر کرتی ہیں، اور یہ تبدیلیاں ٹرانسکرپٹوم میں ظاہر نہیں ہوسکتی ہیں۔
دماغ اور CSF پروٹوم کا آزادانہ طور پر تجزیہ کرنے کے بعد، ہم نے دماغ کے نیٹ ورک کے پیتھوفیسولوجی سے متعلق AD CSF بائیو مارکر کی شناخت کے لیے دو ڈیٹا سیٹس کا ایک جامع تجزیہ کیا۔ ہمیں پہلے دو پروٹوم کے اوورلیپ کی وضاحت کرنی ہوگی۔ اگرچہ یہ بڑے پیمانے پر قبول کیا جاتا ہے کہ CSF AD دماغ میں نیورو کیمیکل تبدیلیوں کی عکاسی کرتا ہے (4)، AD دماغ اور CSF پروٹوم کے درمیان اوورلیپ کی صحیح ڈگری واضح نہیں ہے۔ ہمارے دو پروٹوموں میں پائے جانے والے مشترکہ جین پروڈکٹس کی تعداد کا موازنہ کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ دماغی اسپائنل فلوئڈ میں شناخت کیے گئے تقریباً 70% (n = 1936) پروٹین دماغ میں بھی مقدار کے مطابق تھے (شکل 4A)۔ ان میں سے زیادہ تر اوور لیپنگ پروٹین (n = 1721) کو دریافت دماغی ڈیٹا سیٹ (شکل 4B) سے 44 شریک اظہار کے ماڈیولز میں سے ایک میں نقشہ بنایا گیا ہے۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، دماغ کے چھ سب سے بڑے ماڈیولز (M1 سے M6) نے CSF اوورلیپ کی سب سے بڑی مقدار کی نمائش کی۔ تاہم، دماغ کے چھوٹے ماڈیولز ہیں (مثال کے طور پر، M15 اور M29) جو غیر متوقع طور پر اوورلیپ کی ایک اعلیٰ ڈگری حاصل کرتے ہیں، جو دماغ کے ماڈیول کے سائز سے دوگنا بڑے ہوتے ہیں۔ یہ ہمیں دماغ اور دماغی اسپائنل سیال کے درمیان اوورلیپ کا حساب لگانے کے لیے زیادہ تفصیلی، اعدادوشمار سے چلنے والا طریقہ اپنانے کی ترغیب دیتا ہے۔
(A اور B) دریافت دماغ اور CSF ڈیٹا سیٹ میں پائے جانے والے پروٹین اوورلیپ ہوتے ہیں۔ ان میں سے زیادہ تر اوور لیپنگ پروٹین دماغ کے شریک اظہار کے نیٹ ورک کے 44 شریک اظہار ماڈیولز میں سے ایک سے وابستہ ہیں۔ (سی) دماغی اسپائنل فلوڈ پروٹوم اور دماغی نیٹ ورک پروٹوم کے درمیان اوورلیپ کو دریافت کریں۔ ہیٹ میپ کی ہر قطار ہائپر جیومیٹرک ایف ای ٹی کے علیحدہ اوورلیپ تجزیہ کی نمائندگی کرتی ہے۔ اوپری قطار دماغ کے ماڈیول اور پورے CSF پروٹوم کے درمیان اوورلیپ (گرے/سیاہ رنگ کی شیڈنگ) کو ظاہر کرتی ہے۔ دوسری لائن میں دکھایا گیا ہے کہ دماغی ماڈیولز اور CSF پروٹین (سرخ رنگ میں سایہ دار) کے درمیان اوورلیپ کو AD (P <0.05) میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا ہے۔ تیسری قطار سے پتہ چلتا ہے کہ AD (P <0.05) میں دماغی ماڈیولز اور CSF پروٹین (بلیو شیڈنگ) کے درمیان اوورلیپ نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹ ہے۔ FET سے حاصل کردہ P قدر کو درست کرنے کے لیے BH طریقہ استعمال کریں۔ (D) سیل ٹائپ ایسوسی ایشن اور متعلقہ GO شرائط پر مبنی فولڈنگ ماڈیول پینل۔ ان پینلز میں دماغ سے متعلق کل 271 پروٹین ہوتے ہیں، جن کا CSF پروٹوم میں بامعنی امتیازی اظہار ہوتا ہے۔
سنگل ٹیلڈ FETs کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے CSF پروٹوم اور انفرادی دماغی ماڈیولز کے درمیان پروٹین اوورلیپ کی اہمیت کا اندازہ کیا۔ تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ CSF ڈیٹا سیٹ میں کل 14 دماغی ماڈیولز میں شماریاتی لحاظ سے اہم اوورلیپ ہیں (FDR ایڈجسٹڈ P <0.05)، اور ایک اضافی ماڈیول (M18) جس کا اوورلیپ اہمیت کے قریب ہے (FDR ایڈجسٹڈ P = 0.06) (شکل 4C) ، اوپر کی قطار)۔ ہم ان ماڈیولز میں بھی دلچسپی رکھتے ہیں جو الگ الگ اظہار کردہ CSF پروٹین کے ساتھ مضبوطی سے اوورلیپ ہوتے ہیں۔ لہذا، ہم نے دو اضافی FET تجزیوں کا اطلاق کیا تاکہ اس بات کا تعین کیا جا سکے کہ AD میں کون سا (i) CSF پروٹین میں نمایاں اضافہ ہوا تھا اور (ii) AD میں CSF پروٹین میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی (P <0.05، پیئرڈ ٹی ٹیسٹ AD/control) بامعنی اوورلیپ کے ساتھ دماغی ماڈیولز۔ ان کے درمیان. جیسا کہ شکل 4C کی درمیانی اور نیچے کی قطاروں میں دکھایا گیا ہے، یہ اضافی تجزیے ظاہر کرتے ہیں کہ 44 میں سے 8 دماغی ماڈیولز AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, اور M38) میں شامل پروٹین کے ساتھ نمایاں طور پر اوورلیپ ہوتے ہیں۔ . )، جبکہ صرف دو ماڈیولز (M6 اور M15) نے AD CSF میں کم پروٹین کے ساتھ ایک بامعنی اوورلیپ دکھایا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، تمام 10 ماڈیول 15 ماڈیولز میں ہیں جن میں CSF پروٹوم کے ساتھ سب سے زیادہ اوورلیپ ہے۔ لہذا، ہم فرض کرتے ہیں کہ یہ 15 ماڈیول AD دماغ سے ماخوذ CSF بائیو مارکر کے اعلی پیداواری ذرائع ہیں۔
ہم نے ان 15 اوور لیپنگ ماڈیولز کو WGCNA ٹری ڈایاگرام میں ان کی قربت اور سیل کی اقسام اور جین آنٹولوجی (شکل 4D) کے ساتھ ان کی وابستگی کی بنیاد پر پانچ بڑے پروٹین پینلز میں جوڑ دیا۔ پہلے پینل میں نیوران مارکر اور Synapse سے متعلق پروٹین (M1 اور M12) سے بھرپور ماڈیولز شامل ہیں۔ Synaptic پینل میں کل 94 پروٹین ہوتے ہیں، اور CSF پروٹوم کی سطحوں میں نمایاں تبدیلی آئی ہے، جس سے یہ پانچ پینلز میں دماغ سے متعلق CSF مارکر کا سب سے بڑا ذریعہ ہے۔ دوسرے گروپ (M6 اور M15) نے اینڈوتھیلیل سیل مارکروں اور عروقی جسم کے ساتھ قریبی تعلق کا مظاہرہ کیا، جیسے کہ "زخم کی شفا یابی" (M6) اور "حوصلہ افزائی مدافعتی ردعمل کا ضابطہ" (M15)۔ M15 لیپوپروٹین میٹابولزم سے بھی بہت زیادہ تعلق رکھتا ہے، جو اینڈوتھیلیم (36) سے گہرا تعلق رکھتا ہے۔ عروقی پینل میں دماغ سے متعلق 34 CSF مارکر ہوتے ہیں۔ تیسرے گروپ میں ماڈیولز (M2 اور M4) شامل ہیں جو نمایاں طور پر oligodendrocyte مارکر اور سیل کے پھیلاؤ سے متعلق ہیں۔ مثال کے طور پر، M2 کی اعلیٰ سطحی آنٹولوجی اصطلاحات میں "DNA نقل کا مثبت ضابطہ" اور "purine biosynthesis process" شامل ہیں۔ دریں اثنا، M4 میں سے "گلیئل سیل تفریق" اور "کروموزوم علیحدگی" شامل ہیں۔ مائیلینیشن پینل میں دماغ سے متعلق 49 CSF مارکر ہوتے ہیں۔
چوتھے گروپ میں سب سے زیادہ ماڈیولز (M30, M29, M18, M24, اور M5) ہیں اور تقریباً تمام ماڈیولز مائیکروگلیہ اور آسٹروکائٹ مارکر سے بھرپور ہیں۔ مائیلینیشن پینل کی طرح، چوتھے پینل میں بھی ایسے ماڈیولز (M30، M29، اور M18) ہوتے ہیں جو سیل کے پھیلاؤ سے گہرا تعلق رکھتے ہیں۔ اس گروپ کے دوسرے ماڈیولز کا تعلق امیونولوجیکل اصطلاحات سے ہے، جیسے کہ "امیون ایفیکٹ پروسیس" (M5) اور "امیون ریسپانس ریگولیشن" (M24)۔ گلیل امیون گروپ میں دماغ سے متعلق 42 CSF مارکر ہوتے ہیں۔ آخر میں، آخری پینل میں چار ماڈیولز (M44، M3، M33، اور M38) پر دماغ سے متعلق 52 مارکر شامل ہیں، یہ سب توانائی کے ذخیرہ اور میٹابولزم سے متعلق جسم پر ہیں۔ ان میں سے سب سے بڑے ماڈیولز (M3) کا مائٹوکونڈریا سے گہرا تعلق ہے اور یہ نیوران کے مخصوص مارکر سے بھرپور ہے۔ M38 اس میٹابولوم میں چھوٹے ماڈیول ممبروں میں سے ایک ہے اور اعتدال پسند نیوران کی مخصوصیت کو بھی ظاہر کرتا ہے۔
مجموعی طور پر، یہ پانچ پینل AD کارٹیکس میں سیل کی اقسام اور افعال کی ایک وسیع رینج کی عکاسی کرتے ہیں، اور مجموعی طور پر دماغ سے متعلق 271 CSF مارکر (ٹیبل S2G) پر مشتمل ہے۔ ان MS نتائج کی درستگی کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے proximity extension Asay (PEA) کا استعمال کیا، جو کہ ایک آرتھوگونل اینٹی باڈی پر مبنی ٹیکنالوجی ہے جس میں ملٹی پلیکسنگ کی صلاحیتیں، اعلیٰ حساسیت اور خاصیت ہے، اور دماغی اسپائنل سیال کے نمونوں کا دوبارہ تجزیہ کیا جو ہمیں ان 271 بائیو مارکروں کا سب سیٹ ملا۔ (n = 36)۔ یہ 36 اہداف PEA کے AD ملٹیپل میں تبدیلی کو ظاہر کرتے ہیں، جو ہمارے MS پر مبنی نتائج (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) سے گہرا تعلق رکھتا ہے، جس نے ہمارے جامع MS تجزیہ (شکل S4) کے نتائج کی سختی سے تصدیق کی۔ )۔
ہمارے پانچ گروہوں کی طرف سے جن حیاتیاتی موضوعات پر زور دیا گیا ہے، Synaptic سگنلنگ سے لے کر انرجی میٹابولزم تک، یہ سب AD (1-3) کے روگجنن سے متعلق ہیں۔ لہذا، ان پینلز پر مشتمل تمام 15 ماڈیولز دماغ کے پروٹوم میں AD پیتھالوجی سے متعلق ہیں جسے ہم نے دریافت کیا (شکل 2B)۔ سب سے زیادہ قابل ذکر ہمارے گلیل ماڈیولز کے درمیان اعلیٰ مثبت پیتھولوجیکل ارتباط اور ہمارے سب سے بڑے نیورونل ماڈیولز (M1 اور M3) کے درمیان مضبوط منفی پیتھولوجیکل ارتباط ہے۔ ہمارے نقل شدہ دماغی پروٹوم (فگر S3D) کا امتیازی اظہار کا تجزیہ M5 اور M18 سے ماخوذ گلیل پروٹین کو بھی نمایاں کرتا ہے۔ AsymAD اور علامتی AD میں، سب سے زیادہ بڑھے ہوئے glial پروٹین اور M1 سے متعلق Synapses پروٹین سب سے زیادہ کم ہو جاتے ہیں۔ یہ مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ ہم نے پانچ گروپوں میں جن 271 دماغی اسپائنل فلوئڈ مارکر کی نشاندہی کی ہے ان کا تعلق AD پرانتستا میں بیماری کے عمل سے ہے، بشمول وہ جو ابتدائی غیر علامتی مراحل میں ہوتے ہیں۔
دماغ اور ریڑھ کی ہڈی میں پینل پروٹینز کی تبدیلی کی سمت کا بہتر تجزیہ کرنے کے لیے، ہم نے 15 اوور لیپنگ ماڈیولز میں سے ہر ایک کے لیے درج ذیل کو کھینچا: (i) دماغی ڈیٹا سیٹ میں ماڈیول کی کثرت کی سطح اور (ii) ماڈیول پروٹین فرق دماغی اسپائنل سیال (شکل S5) میں ظاہر ہوتا ہے۔ جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، WGCNA کا استعمال دماغ میں ماڈیول کی کثرت یا خصوصیت پروٹین کی قدر کا تعین کرنے کے لیے کیا جاتا ہے (13)۔ آتش فشاں کا نقشہ دماغی اسپائنل فلوئڈ (AD/کنٹرول) میں ماڈیولر پروٹین کے امتیازی اظہار کو بیان کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ پانچ میں سے تین پینل دماغ اور ریڑھ کی ہڈی میں مختلف اظہار کے رجحانات دکھاتے ہیں۔ Synapse پینل کے دو ماڈیول (M1 اور M12) AD دماغ میں کثرت کی سطح میں کمی کو ظاہر کرتے ہیں، لیکن AD CSF (Figure S5A) میں بڑھے ہوئے پروٹین کے ساتھ نمایاں طور پر اوورلیپ ہوتے ہیں۔ میٹابولوم (M3 اور M38) پر مشتمل نیوران سے متعلق ماڈیولز نے اسی طرح کے دماغ اور دماغی اسپائنل فلوئڈ ایکسپریشن پیٹرن کو متضاد دکھایا (فگر S5E)۔ عروقی پینل نے اظہار کے مختلف رجحانات بھی دکھائے، حالانکہ اس کے ماڈیولز (M6 اور M15) کو AD دماغ میں اعتدال سے بڑھایا گیا تھا اور بیمار CSF (Figure S5B) میں کمی آئی تھی۔ باقی دو پینلز میں بڑے گلیل نیٹ ورکس ہیں جن کے پروٹین دونوں کمپارٹمنٹس (شکل S5، C اور D) میں مستقل طور پر اپ ریگولیٹ ہوتے ہیں۔
براہ کرم نوٹ کریں کہ یہ رجحانات ان پینلز کے تمام مارکروں کے لیے عام نہیں ہیں۔ مثال کے طور پر، Synaptic پینل میں کئی پروٹین شامل ہیں جو AD دماغ اور CSF (Figure S5A) میں نمایاں طور پر کم ہو گئے ہیں۔ ان ڈاون ریگولیٹڈ دماغی اسپائنل فلوئڈ مارکرز میں NPTX2 اور M1 کا VGF، اور M12 کا کروموگرینن B شامل ہیں۔ تاہم، ان مستثنیات کے باوجود، ہمارے زیادہ تر Synaptic مارکر AD ریڑھ کی ہڈی کے سیال میں بلند ہوتے ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ تجزیے ہمارے پانچ پینلز میں سے ہر ایک میں دماغ اور دماغی اسپائنل سیال کی سطح میں اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم رجحانات کی تمیز کرنے کے قابل تھے۔ یہ رجحانات AD میں دماغ اور CSF پروٹین اظہار کے درمیان پیچیدہ اور اکثر مختلف تعلق کو اجاگر کرتے ہیں۔
اس کے بعد، ہم نے اپنے بائیو مارکر کے 271 سیٹ کو انتہائی امید افزا اور تولیدی اہداف (شکل 5A) تک محدود کرنے کے لیے ہائی تھرو پٹ ایم ایس ریپلیکیشن تجزیہ (CSF ریپلیکشن 1) کا استعمال کیا۔ CSF کاپی 1 میں Emory Goizueta ADRC کے کل 96 نمونے شامل ہیں، بشمول کنٹرول، AsymAD، اور AD cohort (ٹیبل S1A)۔ یہ AD کیسز ہلکے علمی کمی (جس کا مطلب ہے MoCA، 20.0 ± 3.8)، اور دماغی اسپائنل فلوئڈ (ٹیبل S1A) میں تصدیق شدہ AD بائیو مارکر میں تبدیلیوں کی خصوصیت ہے۔ ہم نے جو CSF تجزیہ پایا اس کے برعکس، یہ نقل زیادہ موثر اور اعلیٰ تھرو پٹ "سنگل شاٹ" MS طریقہ (آف لائن فریکشنیشن کے بغیر) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جاتا ہے، بشمول نمونہ کی تیاری کا ایک آسان پروٹوکول جو انفرادی نمونوں کی قوت مدافعت کی ضرورت کو ختم کرتا ہے۔ . اس کے بجائے، ایک واحد قوت مدافعت ختم ہونے والا "اضافہ کرنے والا چینل" کا استعمال کم پرچر پروٹین (37) کے سگنل کو بڑھانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اگرچہ یہ کل پروٹوم کوریج کو کم کرتا ہے، یہ واحد شاٹ طریقہ مشین کے وقت کو نمایاں طور پر کم کرتا ہے اور TMT لیبل والے نمونوں کی تعداد میں اضافہ کرتا ہے جن کا قابل عمل تجزیہ کیا جا سکتا ہے (17، 38)۔ مجموعی طور پر، تجزیہ نے 6،487 پیپٹائڈس کی نشاندہی کی، جو 96 معاملات میں 1،183 پروٹوم پر نقشہ بنائے گئے تھے۔ جیسا کہ CSF تجزیہ کے ساتھ ہم نے پایا، صرف وہی پروٹین جو کم از کم 50% نمونوں میں مقدار کے مطابق تھے بعد کے حسابات میں شامل کیے گئے تھے، اور عمر اور جنس کے اثرات کے لیے ڈیٹا کو پیچھے ہٹا دیا گیا تھا۔ اس کی وجہ سے 792 پروٹومز کی حتمی مقدار طے کی گئی، جن میں سے 95% کی شناخت CSF ڈیٹا سیٹ میں بھی کی گئی۔
(A) دماغ سے متعلق CSF پروٹین کے اہداف کی تصدیق پہلے نقل شدہ CSF کوہورٹ میں کی گئی اور حتمی پینل میں شامل (n = 60)۔ (B سے E) پینل بائیو مارکر لیولز (کمپوزٹ زیڈ اسکورز) چار CSF ریپلیکیشن کوہورٹس میں ماپا جاتا ہے۔ ہر نقل کے تجزیے میں کثرت میں ہونے والی تبدیلیوں کی شماریاتی اہمیت کو جانچنے کے لیے ٹکی کی پوسٹ تصحیح کے ساتھ جوڑا بنائے گئے ٹی ٹیسٹ یا ANOVA کا استعمال کیا گیا۔ سی ٹی، کنٹرول۔
چونکہ ہم خاص طور پر اپنے 271 دماغ سے متعلق CSF اہداف کی جامع تجزیہ کے ذریعے تصدیق کرنے میں دلچسپی رکھتے ہیں، اس لیے ہم اس نقل شدہ پروٹوم کی مزید جانچ کو ان مارکروں تک محدود رکھیں گے۔ ان 271 پروٹینوں میں سے، 100 کا CSF نقل 1 میں پتہ چلا۔ شکل S6A کنٹرول اور AD نقل کے نمونوں کے درمیان ان 100 اوورلیپنگ مارکر کے امتیازی اظہار کو ظاہر کرتا ہے۔ Synaptic اور میٹابولائٹ ہسٹون AD میں سب سے زیادہ بڑھتے ہیں، جبکہ ویسکولر پروٹین بیماری میں سب سے زیادہ کم ہوتے ہیں۔ زیادہ تر 100 اوورلیپنگ مارکر (n = 70) نے دو ڈیٹا سیٹس (Figure S6B) میں تبدیلی کی ایک ہی سمت کو برقرار رکھا۔ دماغ سے متعلق یہ 70 توثیق شدہ CSF مارکر (ٹیبل S2H) بڑی حد تک پہلے سے مشاہدہ شدہ پینل ایکسپریشن کے رجحانات کی عکاسی کرتے ہیں، یعنی ویسکولر پروٹینوں کا ڈاون ریگولیشن اور دیگر تمام پینلز کا اپ ریگولیشن۔ ان 70 توثیق شدہ پروٹینوں میں سے صرف 10 نے AD کی کثرت میں تبدیلیاں ظاہر کیں جو ان پینل کے رجحانات سے متصادم تھیں۔ ایک ایسا پینل تیار کرنے کے لیے جو دماغ اور دماغی اسپائنل سیال کے مجموعی رجحان کی بہترین عکاسی کرتا ہو، ہم نے ان 10 پروٹینوں کو دلچسپی کے پینل سے خارج کر دیا جس کی ہم نے آخر میں تصدیق کی (شکل 5A)۔ لہذا، ہمارے پینل میں بالآخر مختلف نمونوں کی تیاری اور MS پلیٹ فارم کے تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے دو آزاد CSF AD کوہورٹس میں تصدیق شدہ کل 60 پروٹین شامل ہیں۔ CSF کاپی 1 کنٹرول اور AD کیسز میں ان فائنل پینلز کے زیڈ سکور ایکسپریشن پلاٹوں نے CSF کوہورٹ میں مشاہدہ کیے گئے پینل کے رجحان کی تصدیق کی ہے (شکل 5B)۔
ان 60 پروٹینوں میں، ایسے مالیکیولز ہیں جو AD کے ساتھ وابستہ ہیں، جیسے کہ آسٹیوپونٹن (SPP1)، جو کہ ایک سوزش والی سائٹوکائن ہے جو بہت سے مطالعات میں AD کے ساتھ منسلک رہی ہے (39-41)، اور GAP43، ایک synaptic پروٹین جو واضح طور پر نیوروڈیجنریشن (42) سے منسلک ہے۔ سب سے زیادہ مکمل طور پر تصدیق شدہ پروٹین دیگر نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں سے متعلق مارکر ہیں، جیسے کہ امیوٹروفک لیٹرل سکلیروسیس (ALS) سے متعلق سپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز 1 (SOD1) اور پارکنسنز کی بیماری سے متعلق ڈیساکراس (PARK7)۔ ہم نے یہ بھی تصدیق کی ہے کہ بہت سے دوسرے مارکر، جیسے SMOC1 اور دماغ سے بھرپور جھلی اٹیچمنٹ سگنلنگ پروٹین 1 (BASP1)، نے نیوروڈیجنریشن سے سابقہ روابط محدود کیے ہیں۔ یہ بات قابل غور ہے کہ CSF پروٹوم میں ان کی کم مجموعی کثرت کی وجہ سے، ہمارے لیے MAPT اور AD سے متعلق کچھ دیگر پروٹینوں (مثال کے طور پر، NEFL اور NRGN) کا قابل اعتماد طریقے سے پتہ لگانے کے لیے اس ہائی تھرو پٹ سنگل شاٹ کا پتہ لگانے کا طریقہ استعمال کرنا مشکل ہے۔ ) ( 43، 44)۔
پھر ہم نے ان 60 ترجیحی پینل مارکر کو تین اضافی نقل کے تجزیوں میں چیک کیا۔ CSF کاپی 2 میں، ہم نے Emory Goizueta ADRC (17) سے 297 کنٹرول اور AD کے نمونوں کے آزاد گروپ کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک واحد TMT-MS کا استعمال کیا۔ CSF نقل 3 میں 120 کنٹرول سے دستیاب TMT-MS ڈیٹا اور لوزان، سوئٹزرلینڈ (45) کے AD مریضوں کا دوبارہ تجزیہ شامل ہے۔ ہم نے ہر ڈیٹاسیٹ میں 60 ترجیحی مارکروں میں سے دو تہائی سے زیادہ کا پتہ لگایا۔ اگرچہ سوئس اسٹڈی نے مختلف MS پلیٹ فارمز اور TMT کوانٹیفیکیشن کے طریقے استعمال کیے (45, 46)، ہم نے اپنے پینل کے رجحانات کو دو بار بار کیے جانے والے تجزیوں (شکل 5، C اور D، اور Tables S2، I، اور J) میں مضبوطی سے دوبارہ پیش کیا۔ اپنے گروپ کی بیماری کی خصوصیت کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے TMT-MS کا استعمال کرتے ہوئے چوتھے ریپلیکیشن ڈیٹا سیٹ (CSF ریپلیکشن 4) کا تجزیہ کیا، جس میں نہ صرف کنٹرول (n = 18) اور AD (n = 17) کیسز شامل تھے، بلکہ PD (n = 17) بھی شامل تھے۔ n = 14))، ALS (n = 18) اور فرنٹوٹیمپورل ڈیمنشیا (FTD) نمونے (n = 11) (ٹیبل S1A)۔ ہم نے اس گروپ (60 میں سے 38) میں تقریبا دو تہائی پینل پروٹینوں کی کامیابی کے ساتھ مقدار درست کردی۔ یہ نتائج پانچوں بائیو مارکر پینلز (شکل 5E اور ٹیبل S2K) میں AD سے متعلق مخصوص تبدیلیوں کو نمایاں کرتے ہیں۔ میٹابولائٹ گروپ میں اضافے نے سب سے مضبوط AD کی خصوصیت ظاہر کی ، اس کے بعد مائیلینیشن اور گلیل گروپ۔ ایک حد تک، FTD ان پینلز کے درمیان اضافہ بھی ظاہر کرتا ہے، جو کہ اسی طرح کی ممکنہ نیٹ ورک تبدیلیوں کی عکاسی کر سکتا ہے (17)۔ اس کے برعکس، ALS اور PD نے کنٹرول گروپ کی طرح تقریباً وہی مائیلینیشن، گلیل، اور میٹابولوم پروفائلز دکھائے۔ مجموعی طور پر، نمونے کی تیاری، MS پلیٹ فارم، اور TMT کوانٹیفیکیشن کے طریقوں میں فرق کے باوجود، یہ بار بار کیے جانے والے تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ ہمارے ترجیحی پینل مارکرز نے 500 سے زیادہ منفرد CSF نمونوں میں AD کے لیے مخصوص تبدیلیاں کی ہیں۔
AD neurodegeneration کو علمی علامات کے آغاز سے کئی سال پہلے بڑے پیمانے پر تسلیم کیا گیا ہے، لہذا AsymAD (5, 31) کے بائیو مارکر کی فوری ضرورت ہے۔ تاہم، زیادہ سے زیادہ شواہد یہ ظاہر کرتے ہیں کہ AsymAD کی حیاتیات یکساں نہیں ہے، اور خطرے اور لچک کا پیچیدہ تعامل بعد میں بیماری کے بڑھنے میں بڑے انفرادی اختلافات کا باعث بنتا ہے (47)۔ اگرچہ AsymAD کیسز کی شناخت کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، بنیادی CSF بائیو مارکر (Aβ1-42، کل ٹاؤ اور p-tau) کی سطحیں قابل اعتماد انداز میں پیش گوئی کرنے کے قابل نہیں ہیں کہ کون ڈیمنشیا (4, 7) میں ترقی کرے گا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ مزید ہوسکتا ہے۔ اس آبادی کے خطرے کو درست طریقے سے ترتیب دینے کے لیے دماغی فزیالوجی کے متعدد پہلوؤں پر مبنی کلی بائیو مارکر ٹولز کو شامل کرنا ضروری ہے۔ اس لیے، ہم نے بعد میں CSF کاپی 1 کی AsymAD آبادی میں اپنے AD سے توثیق شدہ بائیو مارکر پینل کا تجزیہ کیا۔ ان 31 AsymAD کیسز میں غیر معمولی کور بائیو مارکر لیولز (Aβ1–42/total tau ELISA ratio, <5.5) اور مکمل ادراک (مطلب MoCA، 27. ± 2.2) (ٹیبل S1A)۔ اس کے علاوہ، AsymAD والے تمام افراد کا کلینیکل ڈیمنشیا کا اسکور 0 ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ روزانہ علمی یا فعال کارکردگی میں کمی کا کوئی ثبوت نہیں ہے۔
ہم نے سب سے پہلے تمام 96 CSF نقل 1 میں توثیق شدہ پینلز کی سطحوں کا تجزیہ کیا، بشمول AsymAD کوہورٹ۔ ہم نے پایا کہ AsymAD گروپ کے متعدد پینلز میں AD جیسی کثرت تبدیلیاں تھیں، عروقی پینل نے AsymAD میں نیچے کی طرف رجحان دکھایا، جبکہ دیگر تمام پینلز نے اوپر کی طرف رجحان دکھایا (شکل 6A)۔ لہذا، تمام پینلز نے ELISA Aβ1-42 اور کل تاؤ کی سطحوں (شکل 6B) کے ساتھ ایک انتہائی اہم ارتباط ظاہر کیا۔ اس کے برعکس، گروپ اور MoCA سکور کے درمیان ارتباط نسبتاً خراب ہے۔ ان تجزیوں سے سب سے زیادہ حیران کن نتائج میں سے ایک AsymAD کوہورٹ میں پینل کی کثرت کی ایک بڑی رینج ہے۔ جیسا کہ شکل 6A میں دکھایا گیا ہے، AsymAD گروپ کا پینل لیول عام طور پر کنٹرول گروپ اور AD گروپ کے پینل لیول کو عبور کرتا ہے، جو نسبتاً زیادہ تغیر پذیر ہوتا ہے۔ AsymAD کی اس ہیٹروجنیٹی کو مزید دریافت کرنے کے لیے، ہم نے 96 CSF ریپلیکشن 1 کیسز پر ملٹی ڈائمینشنل اسکیلنگ (MDS) تجزیہ کا اطلاق کیا۔ MDS تجزیہ ڈیٹا سیٹ میں بعض متغیرات کی بنیاد پر کیسز کے درمیان مماثلت کو دیکھنے کی اجازت دیتا ہے۔ اس کلسٹر تجزیہ کے لیے، ہم صرف وہ تصدیق شدہ پینل مارکر استعمال کرتے ہیں جن میں CSF دریافت اور نقل 1 پروٹوم (n = 29) (ٹیبل S2L) کی سطح میں شماریاتی لحاظ سے اہم تبدیلی (P <0.05, AD/control) ہے۔ اس تجزیہ نے ہمارے کنٹرول اور AD کیسز (شکل 6C) کے درمیان واضح مقامی جھرمٹ پیدا کیا۔ اس کے برعکس، کچھ AsymAD کیسز واضح طور پر کنٹرول گروپ میں کلسٹر ہوتے ہیں، جبکہ دیگر AD کیسز میں واقع ہوتے ہیں۔ اس AsymAD ہیٹروجنیٹی کو مزید دریافت کرنے کے لیے، ہم نے اپنے MDS نقشے کا استعمال ان AsymAD کیسوں کے دو گروپوں کی وضاحت کے لیے کیا۔ پہلے گروپ میں AsymAD کیسز شامل تھے جو کنٹرول کے قریب کلسٹرڈ تھے (n = 19)، جب کہ دوسرے گروپ میں AsymAD کیسز کی خصوصیت AD (n = 12) کے قریب مارکر پروفائل کے ساتھ تھی۔
(A) CSF ریپلیکیشن 1 کوہورٹ میں تمام 96 نمونوں میں CSF بائیو مارکر گروپ کا اظہار کی سطح (z-score) بشمول AsymAD۔ ٹوکی کے بعد کی تصحیح کے ساتھ تغیر کا تجزیہ پینل کی کثرت کی تبدیلیوں کی شماریاتی اہمیت کا اندازہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ (B) ELISA Aβ1-42 اور CSF کاپی 1 نمونوں میں ایم او سی اے سکور اور کل ٹاؤ لیول کے ساتھ پینل پروٹین وافر مقدار کی سطح (زیڈ سکور) کا ارتباطی تجزیہ۔ متعلقہ P قدر کے ساتھ Pearson کے ارتباط کا گتانک ظاہر ہوتا ہے۔ (C) 96 CSF کاپی 1 کیسز کا MDS 29 توثیق شدہ پینل مارکر کی کثرت کی سطح پر مبنی تھا، جو دریافت اور CSF کاپی 1 ڈیٹا سیٹس [P <0.05 AD/control (CT)] دونوں میں نمایاں طور پر تبدیل ہوئے تھے۔ یہ تجزیہ AsymAD گروپ کو کنٹرول (n = 19) اور AD (n = 12) ذیلی گروپوں میں تقسیم کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ (D) آتش فشاں پلاٹ log2 فولڈ تبدیلی (x-axis) کے ساتھ تمام CSF ریپلیکشن 1 پروٹینوں کا امتیازی اظہار دکھاتا ہے جو دو AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان -log10 شماریاتی P قدر کے مقابلہ میں ہے۔ پینل بائیو مارکر رنگین ہیں۔ (E) CSF نقل 1 سلیکشن گروپ بائیو مارکر کی کثرت کی سطح کو AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان فرق سے ظاہر کیا جاتا ہے۔ ٹکی کا تغیر کے بعد ایڈجسٹ شدہ تجزیہ شماریاتی اہمیت کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
ہم نے ان کنٹرول اور AD جیسے AsymAD کیسز (شکل 6D اور ٹیبل S2L) کے درمیان تفریق پروٹین اظہار کی جانچ کی۔ نتیجے میں آتش فشاں کا نقشہ ظاہر کرتا ہے کہ دونوں گروپوں کے درمیان 14 پینل مارکر نمایاں طور پر تبدیل ہوئے ہیں۔ ان میں سے زیادہ تر مارکر Synapse اور metabolome کے ممبر ہیں۔ تاہم، SOD1 اور myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS)، جو بالترتیب myelin اور glial امیون گروپس کے ممبر ہیں، بھی اس گروپ سے تعلق رکھتے ہیں (شکل 6، D اور E)۔ عروقی پینل نے دو مارکروں کا بھی حصہ ڈالا جو AD جیسے AsymAD گروپ میں نمایاں طور پر کم ہوئے تھے، بشمول AE بائنڈنگ پروٹین 1 (AEBP1) اور خاندانی ممبر C9 کی تکمیل۔ ELISA AB1-42 (P = 0.38) اور p-tau (P = 0.28) میں کنٹرول اور AD جیسے AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں تھا، لیکن کل تاؤ کی سطح (P = 0.0031) میں واقعی ایک اہم فرق تھا۔ ) (تصویر S7)۔ متعدد پینل مارکر ہیں جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ دو AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان تبدیلیاں کل ٹاؤ لیولز (مثال کے طور پر YWHAZ، SOD1، اور MDH1) (شکل 6E) سے زیادہ اہم ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ہمارے توثیق شدہ پینل میں بائیو مارکر شامل ہو سکتے ہیں جو غیر علامتی بیماری والے مریضوں کی ذیلی قسم اور ممکنہ خطرے کی سطح بندی کر سکتے ہیں۔
AD کے پیچھے مختلف پیتھوفیسولوجی کی بہتر پیمائش اور ہدف کے لیے سسٹم پر مبنی بائیو مارکر ٹولز کی فوری ضرورت ہے۔ ان ٹولز سے توقع کی جاتی ہے کہ وہ نہ صرف ہمارے AD تشخیصی فریم ورک کو تبدیل کریں گے بلکہ موثر، مریض کے لیے مخصوص علاج کی حکمت عملیوں کو اپنانے کو بھی فروغ دیں گے (1، 2)۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے ویب پر مبنی CSF بائیو مارکرز کی شناخت کرنے کے لیے AD دماغ اور CSF پر ایک غیر جانبدارانہ جامع پروٹومکس اپروچ کا اطلاق کیا جو دماغ پر مبنی پیتھوفیسولوجی کی ایک وسیع رینج کی عکاسی کرتے ہیں۔ ہمارے تجزیے نے پانچ CSF بائیو مارکر پینل تیار کیے، جو (i) Synapses، خون کی نالیوں، مائیلین، مدافعتی اور میٹابولک dysfunction کی عکاسی کرتے ہیں۔ (ii) مختلف MS پلیٹ فارمز پر مضبوط تولیدی صلاحیت کا مظاہرہ کریں؛ (iii) AD کے ابتدائی اور آخری مراحل میں ترقی پسند بیماری سے متعلق تبدیلیاں دکھائیں۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج AD ریسرچ اور کلینیکل ایپلی کیشنز کے لیے متنوع، قابل اعتماد، ویب پر مبنی بائیو مارکر ٹولز کی ترقی کی جانب ایک امید افزا قدم کی نمائندگی کرتے ہیں۔
ہمارے نتائج AD برین نیٹ ورک پروٹوم کی انتہائی محفوظ تنظیم کو ظاہر کرتے ہیں اور سسٹم پر مبنی بائیو مارکر کی نشوونما کے لیے بطور اینکر اس کے استعمال کی حمایت کرتے ہیں۔ ہمارے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ AD اور AsymAD دماغوں پر مشتمل دو آزاد TMT-MS ڈیٹاسیٹس میں مضبوط ماڈیولریٹی ہے۔ یہ نتائج ہمارے پچھلے کام کو بڑھاتے ہیں، جو سامنے والے، پیریٹل، اور دنیاوی پرانتستا (17) میں متعدد آزاد گروہوں سے 2,000 سے زیادہ دماغی بافتوں کے طاقتور ماڈیولز کے تحفظ کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ یہ متفقہ نیٹ ورک موجودہ تحقیق میں مشاہدہ کی گئی بیماریوں سے متعلق مختلف تبدیلیوں کی عکاسی کرتا ہے، بشمول گلیل سے بھرپور سوزش والے ماڈیولز میں اضافہ اور نیوران سے بھرپور ماڈیولز کی کمی۔ موجودہ تحقیق کی طرح، یہ بڑے پیمانے پر نیٹ ورک AsymAD میں اہم ماڈیولر تبدیلیاں بھی پیش کرتا ہے، جس میں مختلف قسم کے preclinical pathophysiology (17) کو دکھایا گیا ہے۔
تاہم، اس انتہائی قدامت پسند نظام پر مبنی فریم ورک کے اندر، خاص طور پر AD کے ابتدائی مراحل میں افراد کے درمیان، زیادہ عمدہ حیاتیاتی نسبت ہے۔ ہمارا بائیو مارکر پینل AsymAD میں دو ذیلی گروپوں کی عکاسی کرنے کے قابل ہے، جو ایک سے زیادہ CSF مارکر کے نمایاں تفریق اظہار کو ظاہر کرتے ہیں۔ ہمارا گروپ ان دو ذیلی گروپوں کے درمیان حیاتیاتی فرق کو اجاگر کرنے میں کامیاب تھا، جو بنیادی AD بائیو مارکر کی سطح پر واضح نہیں تھے۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، ان AsymAD افراد کا Aβ1-42/کل ٹاؤ تناسب غیر معمولی طور پر کم تھا۔ تاہم، دو AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان صرف ٹاؤ کی کل سطحیں نمایاں طور پر مختلف تھیں، جبکہ Aβ1-42 اور p-tau کی سطحیں نسبتاً قابل موازنہ رہیں۔ چونکہ اعلی CSF تاؤ Aβ1-42 کی سطح (7) کے مقابلے میں علمی علامات کا بہتر پیش گو معلوم ہوتا ہے، ہمیں شبہ ہے کہ AsymAD کے دو ساتھیوں میں بیماری کے بڑھنے کے مختلف خطرات ہو سکتے ہیں۔ ہمارے AsymAD کے محدود نمونے کے سائز اور طول بلد ڈیٹا کی کمی کے پیش نظر، اعتماد کے ساتھ ان نتائج کو اخذ کرنے کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔ تاہم، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ نظام پر مبنی CSF پینل بیماری کے غیر علامتی مرحلے کے دوران افراد کو مؤثر طریقے سے سٹرائیفائی کرنے کی ہماری صلاحیت کو بڑھا سکتا ہے۔
مجموعی طور پر، ہماری تلاشیں AD کے روگجنن میں متعدد حیاتیاتی افعال کے کردار کی تائید کرتی ہیں۔ تاہم، غیر منظم توانائی میٹابولزم ہمارے پانچوں توثیق شدہ لیبلنگ پینلز کا نمایاں موضوع بن گیا۔ میٹابولک پروٹین، جیسے ہائپوکسینتھائن-گوانائن فاسفوریبوسائلٹرانسفیریز 1 (HPRT1) اور لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز A (LDHA)، سب سے زیادہ مضبوطی سے تصدیق شدہ Synaptic بائیو مارکر ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ AD CSF میں اضافہ انتہائی تولیدی جنسی ہے۔ ہماری خون کی نالیوں اور گلیل پینلز میں آکسیڈیٹیو مادوں کے میٹابولزم میں شامل کئی مارکر بھی ہوتے ہیں۔ یہ نتائج اس کلیدی کردار کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں جو پورے دماغ میں میٹابولک عمل ادا کرتے ہیں، نہ صرف نیوران کی اعلی توانائی کی طلب کو پورا کرنے کے لیے، بلکہ ایسٹروائٹس اور دیگر گلیل سیلز (17، 48) کی اعلی توانائی کی طلب کو بھی پورا کرتے ہیں۔ ہمارے نتائج بڑھتے ہوئے شواہد کی تائید کرتے ہیں کہ ریڈوکس صلاحیت میں تبدیلی اور توانائی کے راستوں میں رکاوٹ AD کے روگجنن میں شامل کئی کلیدی عملوں کے درمیان بنیادی ربط ہو سکتی ہے، بشمول مائٹوکونڈریل عوارض، گلیل ثالثی سوزش، اور عروقی نقصان (49)۔ اس کے علاوہ، میٹابولک سیریبرو اسپائنل فلوئڈ بائیو مارکرز ہمارے کنٹرول اور AD جیسے AsymAD ذیلی گروپوں کے درمیان بڑی تعداد میں فرق سے بھرپور پروٹین پر مشتمل ہوتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ بیماری کے ابتدائی مرحلے میں ان توانائی اور ریڈوکس راستوں میں خلل بہت اہم ہو سکتا ہے۔
دماغ اور دماغی اسپائنل فلوڈ پینل کے مختلف رجحانات جو ہم نے مشاہدہ کیے ہیں ان کے بھی دلچسپ حیاتیاتی اثرات ہیں۔ نیوران سے بھرپور Synapses اور metabolomes AD کے دماغ میں کمی کی سطح اور دماغی اسپائنل سیال کی کثرت کو ظاہر کرتے ہیں۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ نیوران اپنے متعدد خصوصی سگنلز (50) کے لیے توانائی فراہم کرنے کے لیے Synapses میں توانائی پیدا کرنے والے مائٹوکونڈریا سے بھرپور ہوتے ہیں، ان دونوں نیوران گروپس کے اظہاری پروفائلز میں مماثلت کی توقع کی جاتی ہے۔ نیوران کا نقصان اور خراب خلیوں کا اخراج بعد کی بیماری میں دماغ اور CSF پینل کے رجحانات کی وضاحت کر سکتا ہے، لیکن وہ ان ابتدائی پینل تبدیلیوں کی وضاحت نہیں کر سکتے جن کا ہم مشاہدہ کرتے ہیں (13)۔ ابتدائی اسیمپٹومیٹک بیماری میں ان نتائج کی ایک ممکنہ وضاحت غیر معمولی synaptic pruning ہے۔ ماؤس ماڈلز میں نئے شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ مائیکروگلیہ ثالثی Synaptic phagocytosis AD میں غیر معمولی طور پر چالو ہو سکتا ہے اور دماغ میں Synapse کے ابتدائی نقصان کا باعث بن سکتا ہے (51)۔ یہ ضائع شدہ Synaptic مواد CSF میں جمع ہو سکتا ہے، یہی وجہ ہے کہ ہم نیوران پینل میں CSF میں اضافے کا مشاہدہ کرتے ہیں۔ مدافعتی ثالثی Synaptic کی کٹائی جزوی طور پر گلیل پروٹینوں میں اضافے کی بھی وضاحت کر سکتی ہے جو ہم دماغ اور دماغی اسپائنل سیال میں بیماری کے پورے عمل میں دیکھتے ہیں۔ Synaptic pruning کے علاوہ، exocytic pathway میں مجموعی طور پر اسامانیتاوں کے دماغ اور CSF کے نیورونل مارکر کے مختلف تاثرات بھی ہو سکتے ہیں۔ متعدد مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ AD دماغ کے روگجنن میں exosomes کے مواد میں تبدیلی آئی ہے (52)۔ ایکسٹرا سیلولر راستہ Aβ (53، 54) کے پھیلاؤ میں بھی شامل ہے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ exosomal سراو کو دبانے سے AD ٹرانسجینک ماؤس ماڈلز (55) میں AD جیسی پیتھالوجی کم ہو سکتی ہے۔
ایک ہی وقت میں، عروقی پینل میں پروٹین نے AD دماغ میں اعتدال پسند اضافہ دکھایا، لیکن CSF میں نمایاں طور پر کمی واقع ہوئی۔ خون کے دماغ کی رکاوٹ (BBB) کی خرابی جزوی طور پر ان نتائج کی وضاحت کر سکتی ہے۔ بہت سے آزاد پوسٹ مارٹم انسانی مطالعات نے AD (56، 57) میں بی بی بی کی خرابی کا مظاہرہ کیا ہے۔ ان مطالعات نے اینڈوتھیلیل خلیوں کی اس مضبوطی سے مہربند پرت کے ارد گرد مختلف غیر معمولی سرگرمیوں کی تصدیق کی ہے، بشمول دماغ کی کیپلیری رساو اور خون سے پیدا ہونے والے پروٹین (57) کا پیریواسکولر جمع۔ یہ دماغ میں بلند عروقی پروٹین کے لیے ایک سادہ سی وضاحت فراہم کر سکتا ہے، لیکن یہ دماغی اسپائنل سیال میں ان ہی پروٹینوں کی کمی کی مکمل وضاحت نہیں کر سکتا۔ ایک امکان یہ ہے کہ مرکزی اعصابی نظام بڑھتے ہوئے سوزش اور آکسیڈیٹیو تناؤ کے مسئلے کو حل کرنے کے لیے ان مالیکیولز کو فعال طور پر الگ کر رہا ہے۔ اس پینل میں کچھ انتہائی شدید CSF پروٹینز میں کمی، خاص طور پر جو لیپوپروٹین ریگولیشن میں شامل ہیں، ان کا تعلق سوزش کی نقصان دہ سطحوں کی روک تھام اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کے نیورو پروٹیکٹو عمل سے ہے۔ یہ Paroxonase 1 (PON1) کے لیے سچ ہے، ایک لیپوپروٹین بائنڈنگ اینزائم جو گردش میں آکسیڈیٹیو تناؤ کی سطح کو کم کرنے کے لیے ذمہ دار ہے (58، 59)۔ Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) ویسکولر گروپ کا ایک اور نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹڈ مارکر ہے۔ یہ لپڈ ٹرانسپورٹر بیکونین کا پیش خیمہ ہے، جو سوزش کو دبانے اور اعصابی تحفظ (60، 61) میں بھی شامل ہے۔
مختلف دلچسپ مفروضوں کے باوجود، بائیو کیمیکل بیماری کے طریقہ کار کا براہ راست پتہ لگانے میں ناکامی دریافت پر مبنی پروٹومکس تجزیہ کی ایک معروف حد ہے۔ لہذا، ان بائیو مارکر پینلز کے پیچھے میکانزم کو اعتماد کے ساتھ بیان کرنے کے لیے مزید تحقیق ضروری ہے۔ MS پر مبنی طبی تجزیہ کی ترقی کی طرف بڑھنے کے لیے، مستقبل کی سمت میں بڑے پیمانے پر بائیو مارکر کی تصدیق کے لیے ہدف شدہ مقداری طریقوں کے استعمال کی بھی ضرورت ہوتی ہے، جیسے کہ منتخب یا متوازی ردعمل کی نگرانی (62)۔ ہم نے حال ہی میں یہاں بیان کردہ CSF پروٹین کی بہت سی تبدیلیوں کی توثیق کرنے کے لیے متوازی رد عمل کی نگرانی (63) کا استعمال کیا۔ متعدد ترجیحی پینل کے اہداف کو اہم درستگی کے ساتھ مقدار میں طے کیا گیا ہے، بشمول YWHAZ، ALDOA، اور SMOC1، جو بالترتیب ہمارے Synapse، میٹابولزم، اور سوزش کے پینلز کا نقشہ بناتے ہیں (63)۔ Independent Data Acquisition (DIA) اور دیگر MS پر مبنی حکمت عملی بھی ہدف کی تصدیق کے لیے کارآمد ہو سکتی ہے۔ بڈ وغیرہ۔ (64) حال ہی میں یہ ظاہر کیا گیا ہے کہ ہمارے CSF دریافت ڈیٹا سیٹ اور آزاد DIA-MS ڈیٹا سیٹ میں شناخت شدہ AD بائیو مارکر کے درمیان ایک اہم اوورلیپ ہے، جو تین مختلف یورپی گروہوں کے تقریباً 200 CSF نمونوں پر مشتمل ہے۔ یہ حالیہ مطالعات ہمارے پینلز کی قابل اعتماد MS پر مبنی شناخت میں تبدیل ہونے کی صلاحیت کی حمایت کرتے ہیں۔ کلیدی AD بائیو مارکر کی مزید نشوونما کے لیے روایتی اینٹی باڈی اور اپٹیمر پر مبنی پتہ لگانا بھی اہم ہے۔ CSF کی کم کثرت کی وجہ سے، اعلی تھرو پٹ MS طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے ان بائیو مارکروں کا پتہ لگانا زیادہ مشکل ہے۔ NEFL اور NRGN کم کثرت والے CSF بائیو مارکرز کی دو ایسی مثالیں ہیں، جو ہمارے جامع تجزیے میں پینل کے ساتھ نقش کیے گئے ہیں، لیکن ہماری واحد MS حکمت عملی کا استعمال کرتے ہوئے قابل اعتماد طریقے سے پتہ نہیں لگایا جا سکتا۔ متعدد اینٹی باڈیز پر مبنی اہدافی حکمت عملی، جیسے PEA، ان مارکروں کی طبی تبدیلی کو فروغ دے سکتی ہے۔
مجموعی طور پر، یہ مطالعہ مختلف سسٹمز پر مبنی CSF AD بائیو مارکر کی شناخت اور تصدیق کے لیے ایک منفرد پروٹومکس اپروچ فراہم کرتا ہے۔ اضافی AD کوہورٹس اور MS پلیٹ فارمز میں ان مارکر پینلز کو بہتر بنانا AD کے خطرے کی سطح بندی اور علاج کو آگے بڑھانے کے لیے امید افزا ثابت ہو سکتا ہے۔ ایسے مطالعات جو وقت کے ساتھ ساتھ ان پینلز کی طول بلد کی سطح کا جائزہ لیتے ہیں اس بات کا تعین کرنے کے لیے بھی اہم ہیں کہ مارکر کا کون سا امتزاج ابتدائی بیماری کے خطرے اور بیماری کی شدت میں تبدیلی کو بہتر بناتا ہے۔
CSF کے ذریعے نقل کیے گئے 3 نمونوں کے علاوہ، اس مطالعے میں استعمال ہونے والے تمام CSF نمونے Emory ADRC یا قریبی متعلقہ تحقیقی اداروں کے زیر اہتمام جمع کیے گئے تھے۔ ایموری CSF نمونوں کے کل چار سیٹ ان پروٹومکس اسٹڈیز میں استعمال کیے گئے تھے۔ CSF کوہورٹ میں 20 صحت مند کنٹرول اور 20 AD مریضوں کے نمونے پائے گئے۔ CSF کاپی 1 میں 32 صحت مند کنٹرولز، 31 AsymAD افراد، اور 33 AD افراد کے نمونے شامل ہیں۔ CSF کاپی 2 میں 147 کنٹرولز اور 150 AD کے نمونے ہیں۔ کثیر بیماری CSF نقل 4 کوہورٹ میں 18 کنٹرولز، 17 AD، 19 ALS، 13 PD، اور 11 FTD نمونے شامل تھے۔ ایموری یونیورسٹی کے ادارہ جاتی جائزہ بورڈ کے منظور کردہ معاہدے کے مطابق، تمام ایموری مطالعہ کے شرکاء نے باخبر رضامندی حاصل کی۔ 2014 کے نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ایجنگ بیسٹ پریکٹس گائیڈلائنز برائے الزائمر سینٹرز (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) کے مطابق، دماغی رطوبت کو لمبر پنکچر کے ذریعے جمع اور ذخیرہ کیا گیا تھا۔ کنٹرول اور AsymAD اور AD مریضوں نے Emory Cognitive Neurology Clinic یا Goizueta ADRC میں معیاری علمی تشخیص حاصل کی۔ ان کے دماغی اسپائنل سیال کے نمونوں کا تجربہ INNO-BIA AlzBio3 Luminex نے ELISA Aβ1-42، کل تاؤ اور p-tau تجزیہ (65) کے لیے کیا تھا۔ ELISA اقدار قائم شدہ AD بائیو مارکر کٹ آف معیار (66, 67) کی بنیاد پر مضامین کی تشخیصی درجہ بندی کی حمایت کے لیے استعمال کی جاتی ہیں۔ دیگر CSF تشخیص (FTD، ALS، اور PD) کے لیے بنیادی آبادیاتی اور تشخیصی ڈیٹا بھی Emory ADRC یا منسلک تحقیقی اداروں سے حاصل کیا جاتا ہے۔ ایموری CSF کے ان کیسز کا خلاصہ کیس میٹا ڈیٹا ٹیبل S1A میں پایا جا سکتا ہے۔ سوئس CSF نقل 3 کوہورٹ کی خصوصیات پہلے شائع کی جا چکی ہیں (45)۔
CSF کو نمونہ ملا۔ CSF ڈیٹا سیٹ کی ہماری دریافت کی گہرائی کو بڑھانے کے لیے، ٹرپسنائزیشن سے پہلے اعلی کثرت والے پروٹین کی مدافعتی کھپت کی گئی تھی۔ مختصراً، 40 انفرادی CSF نمونوں میں سے 130 μl CSF اور ہائی سلیکٹ ٹاپ14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) کے مساوی حجم (130 μl) کو اسپن کالم (تھرمو فشر سائنٹیفک، A8988) میں رکھا گیا تھا۔ درجہ حرارت انکیوبیٹ)۔ 15 منٹ تک گھومنے کے بعد، نمونے کو 1000 گرام پر 2 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کریں۔ ایک 3K الٹرا سینٹرفیوگل فلٹر ڈیوائس (ملی پور، UFC500396) 30 منٹ کے لیے 14,000 گرام پر سینٹرفیوگنگ کرکے اخراج کے نمونے کو مرکوز کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تمام نمونوں کی مقدار کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین کے ساتھ 75 μl تک پتلا کریں۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے مطابق بائیسنچونینک ایسڈ (بی سی اے) کے طریقہ کار سے پروٹین کے ارتکاز کی جانچ کی گئی۔ تمام 40 نمونوں میں سے مدافعتی CSF (60 μl) lysyl endopeptidase (LysC) اور ٹرپسن کے ساتھ ہضم ہوا تھا۔ مختصراً، نمونہ کو 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine اور 3 μl 0.8 M chloroacetamide کے ساتھ 90 ° C پر 10 منٹ کے لیے کم کیا گیا اور پھر 15 منٹ کے لیے پانی کے غسل میں سونیکیٹ کیا گیا۔ نمونے کو 193 μl 8 M یوریا بفر [8 M یوریا اور 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] کے ساتھ 6 M یوریا کی حتمی حراستی تک پتلا کیا گیا تھا۔ LysC (4.5 μg؛ Wako) کمرے کے درجہ حرارت پر راتوں رات ہاضمے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ اس کے بعد نمونے کو 50 ایم ایم امونیم بائی کاربونیٹ (ABC) (68) کے ساتھ 1 M یوریا میں ملایا گیا۔ ٹرپسن (پرومیگا) کی مساوی مقدار (4.5 μg) شامل کریں، اور پھر نمونے کو 12 گھنٹے تک سینکیں۔ 1% فارمک ایسڈ (FA) اور 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (66) کے ہضم شدہ پیپٹائڈ محلول کو تیزاب کریں، اور پھر 50 ملی گرام Sep-Pak C18 کالم (پانی) کے ساتھ ڈیسالٹ کریں جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے (25) . اس کے بعد پیپٹائڈ کو 50% acetonitrile (ACN) کے 1 ملی لیٹر میں نکالا گیا۔ بیچوں (25) میں پروٹین کی مقدار کو معیاری بنانے کے لیے، تمام 40 CSF نمونوں میں سے 100 μl aliquots کو ملا کر ایک مخلوط نمونہ تیار کیا گیا، جسے پھر پانچ عالمی داخلی معیار (GIS) (48) نمونوں میں تقسیم کیا گیا۔ تمام انفرادی نمونے اور مشترکہ معیار تیز رفتار ویکیوم (Labconco) کے ذریعے خشک کیے جاتے ہیں۔
CSF نمونے کو کاپی کرتا ہے۔ ڈیون اور ساتھیوں نے پہلے CSF کاپی 3 نمونوں (45، 46) کے مدافعتی کمی اور عمل انہضام کو بیان کیا ہے۔ بقیہ نقل کے نمونے انفرادی طور پر مدافعتی نہیں تھے۔ ان غیر ہٹائے گئے نمونوں کو ٹرپسن میں ہضم کریں جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (17)۔ ہر بار بار کیے جانے والے تجزیے کے لیے، ہر نمونے سے ایلیوٹڈ پیپٹائڈ کے 120 μl ایلی کوٹس کو ایک ساتھ جمع کیا گیا اور ٹی ایم ٹی کے لیبل والے عالمی داخلی معیار (48) کے طور پر استعمال ہونے کے لیے مساوی حجم کے ایلی کوٹس میں تقسیم کیا گیا۔ تمام انفرادی نمونے اور مشترکہ معیار تیز رفتار ویکیوم (Labconco) کے ذریعے خشک کیے جاتے ہیں۔ کم کثرت والے CSF پروٹین کے سگنل کو بڑھانے کے لیے، ہر نمونے سے 125 μl کو ملا کر، ہر نقل کے تجزیہ کے لیے ایک "بہتر" نمونہ تیار کیا گیا تھا [یعنی، ایک حیاتیاتی نمونہ جو تحقیقی نمونے کی نقل کرتا ہے، لیکن دستیاب مقدار بہت بڑا (37، 69)] ایک مخلوط CSF نمونے میں ضم ہو گیا (17)۔ اس کے بعد مخلوط نمونے کو 12 ملی لیٹر ہائی سلیکٹ ٹاپ 14 ابینڈنس پروٹین ریموول رال (تھرمو فشر سائنٹیفک، A36372) کا استعمال کرتے ہوئے مدافعتی بنایا گیا، جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، اور بعد میں متعدد TMT لیبلنگ میں شامل ہے۔
پوسٹ ٹائم: اگست 27-2021