لیزر سے گرم سونے کے نینو پارٹیکلز کے ساتھ وٹرو میں اعلی درجہ حرارت پر زندگی کا مشاہدہ کیا جاتا ہے۔

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔ آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔ اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
تھرموفیلس مائکروجنزم ہیں جو اعلی درجہ حرارت پر پروان چڑھتے ہیں۔ ان کا مطالعہ کرنے سے اس بارے میں قیمتی معلومات مل سکتی ہیں کہ زندگی کس طرح انتہائی حالات میں ڈھلتی ہے۔ تاہم، روایتی نظری خوردبین کے ساتھ اعلی درجہ حرارت کے حالات کو حاصل کرنا مشکل ہے. مقامی مزاحمتی برقی حرارت پر مبنی متعدد گھریلو حل تجویز کیے گئے ہیں، لیکن کوئی آسان تجارتی حل نہیں ہے۔ اس مقالے میں، ہم صارف کے ماحول کو معتدل رکھتے ہوئے تھرمو فائل اسٹڈیز کے لیے اعلی درجہ حرارت فراہم کرنے کے لیے مائکروسکوپ فیلڈ آف ویو پر مائیکرو اسکیل لیزر ہیٹنگ کا تصور متعارف کراتے ہیں۔ اعتدال پسند لیزر کی شدت پر مائکرو اسکیل ہیٹنگ کو گولڈ نینو پارٹیکل لیپت سبسٹریٹ کا استعمال کرتے ہوئے بائیو مطابقت پذیر اور موثر روشنی جذب کرنے والے کے طور پر حاصل کیا جاسکتا ہے۔ مائیکرو اسکیل فلوڈ کنویکشن، سیل ریٹینشن، اور سینٹری فیوگل تھرموفورٹک موشن کے ممکنہ اثرات پر تبادلہ خیال کیا گیا ہے۔ یہ طریقہ دو انواع میں ظاہر کیا گیا ہے: (i) جیوباسیلس سٹیروتھرموفیلس، ایک فعال تھرموفیلک بیکٹیریا جو تقریباً 65°C پر دوبارہ پیدا ہوتا ہے، جسے ہم نے مائکرو سکیل ہیٹنگ کے تحت اگنے، بڑھنے اور تیرنے کا مشاہدہ کیا ہے۔ (ii) Thiobacillus sp.، ایک بہترین ہائپر تھرموفیلک آثار قدیمہ۔ 80 ° C پر یہ کام جدید اور سستی مائکروسکوپی ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے تھرمو فیلک مائکروجنزموں کے سادہ اور محفوظ مشاہدے کی راہ ہموار کرتا ہے۔
اربوں سالوں میں، زمین پر زندگی نے ماحولیاتی حالات کی ایک وسیع رینج کو اپنانے کے لیے تیار کیا ہے جو کبھی کبھی ہمارے انسانی نقطہ نظر سے انتہائی سمجھے جاتے ہیں۔ خاص طور پر، کچھ تھرموفیلک مائکروجنزم (بیکٹیریا، آثار قدیمہ، فنگس) جنہیں تھرموفیلز کہتے ہیں درجہ حرارت کی حد میں 45°C سے 122°C1، 2، 3، 4 تک پروان چڑھتے ہیں۔ تھرموفیلز مختلف ماحولیاتی نظاموں میں رہتے ہیں، جیسے کہ گہرے سمندر کے ہائیڈرو تھرمل وینٹ، گرم چشمہ یا آتش فشاں علاقے۔ ان کی تحقیق نے گزشتہ چند دہائیوں میں کم از کم دو وجوہات کی بنا پر کافی دلچسپی پیدا کی ہے۔ سب سے پہلے، ہم ان سے سیکھ سکتے ہیں، مثال کے طور پر، تھرمو فائلز 5، 6، انزائمز 7، 8 اور جھلی 9 اتنے زیادہ درجہ حرارت پر کیسے مستحکم ہوتے ہیں، یا تھرمو فائلز تابکاری کی انتہائی سطح کو کیسے برداشت کر سکتے ہیں۔ دوسرا، یہ بہت سے اہم بائیوٹیکنالوجی ایپلی کیشنز کی بنیاد ہیں1,11,12 جیسے ایندھن کی پیداوار13,14,15,16، کیمیائی ترکیب (ڈائی ہائیڈرو، الکوحل، میتھین، امینو ایسڈ وغیرہ) 13. خاص طور پر، فی الحال معروف پولیمریز چین ری ایکشن (PCR)19 میں تھرموفیلک بیکٹیریم تھرمس ​​ایکواٹیکس سے الگ تھلگ ایک انزائم (Taq polymerase) شامل ہے، جو دریافت ہونے والے پہلے تھرموفیلز میں سے ایک ہے۔
تاہم، تھرمو فائلز کا مطالعہ کوئی آسان کام نہیں ہے اور اسے کسی بھی حیاتیاتی تجربہ گاہ میں بہتر نہیں بنایا جا سکتا۔ خاص طور پر، کسی بھی معیاری لائٹ مائکروسکوپ کے ساتھ وٹرو میں زندہ تھرموفیلز کا مشاہدہ نہیں کیا جا سکتا، یہاں تک کہ تجارتی طور پر دستیاب ہیٹنگ چیمبروں کے ساتھ، عام طور پر درجہ حرارت 40 ° C سے کم درجہ حرارت پر ہوتا ہے۔ 1990 کی دہائی سے، صرف چند تحقیقی گروپوں نے خود کو ہائی ٹمپریچر مائیکروسکوپی (HTM) سسٹمز کے تعارف کے لیے وقف کیا ہے۔ 1994 میں Glukh et al. ہیٹنگ/کولنگ چیمبر کا تصور ایک پیلٹیئر سیل کے استعمال کی بنیاد پر کیا گیا تھا جو انیروبیسیٹی 20 کو برقرار رکھنے کے لیے بند مستطیل کیپلیریوں کے درجہ حرارت کو کنٹرول کرتا ہے۔ ڈیوائس کو 2 °C/s کی شرح سے 100 °C تک گرم کیا جا سکتا ہے، جس سے مصنفین کو ہائپر تھرموفیلک بیکٹیریم تھرموٹوگا میریٹیما21 کی حرکت پذیری کا مطالعہ کرنے کی اجازت ملتی ہے۔ 1999 میں Horn et al. ایک بہت ہی ملتا جلتا آلہ تیار کیا گیا ہے، جو اب بھی سیل ڈویژن/کنکشن کا مطالعہ کرنے کے لیے کمرشل مائکروسکوپی کے لیے موزوں گرم کیپلیریوں کے استعمال پر مبنی ہے۔ نسبتاً غیرفعالیت کے طویل عرصے کے بعد، 2012 میں موثر HTMs کی تلاش دوبارہ شروع ہوئی، خاص طور پر Wirth گروپ کے کاغذات کی ایک سیریز کے سلسلے میں جس میں Horn et al کی ایجاد کردہ ڈیوائس کا استعمال کیا گیا تھا۔ پندرہ سال پہلے، ہائپرتھرموفائلز سمیت بڑی تعداد میں آثار قدیمہ کی حرکت پذیری کا مطالعہ 100 ° C تک درجہ حرارت پر گرم کیپلیریوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا 23,24۔ انہوں نے تیز حرارت حاصل کرنے کے لیے اصل خوردبین میں بھی ترمیم کی (مقررہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے لیے 35 منٹ کی بجائے کئی منٹ) اور درمیانے درجے میں 2 سینٹی میٹر سے زیادہ کا لکیری درجہ حرارت کا میلان حاصل کیا۔ یہ درجہ حرارت گریڈینٹ شیپنگ ڈیوائس (TGFD) حیاتیاتی لحاظ سے متعلقہ فاصلوں 24, 25 پر درجہ حرارت کے میلان کے اندر بہت سے تھرمو فائلز کی نقل و حرکت کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔
بند کیپلیریوں کو گرم کرنا زندہ تھرموفیلز کا مشاہدہ کرنے کا واحد طریقہ نہیں ہے۔ 2012 میں، Kuwabara et al. گرمی سے بچنے والے چپکنے والے (Super X2؛ Cemedine، Japan) کے ساتھ سیل بند گھریلو ڈسپوزایبل Pyrex چیمبر استعمال کیے گئے تھے۔ نمونے تجارتی طور پر دستیاب شفاف ہیٹنگ پلیٹ (مائکرو ہیٹ پلیٹ، کیٹازاٹو کارپوریشن، جاپان) پر رکھے گئے تھے جو 110 ° C تک گرم کرنے کے قابل تھے، لیکن اصل میں بائیو امیجنگ کے لیے نہیں تھے۔ مصنفین نے 65 ڈگری سینٹی گریڈ پر اینیروبک تھرموفیلک بیکٹیریا (تھرموسیفو گلوبیفارمنس، دگنا وقت 24 منٹ) کی موثر تقسیم کا مشاہدہ کیا۔ 2020 میں، پلشین وغیرہ۔ کمرشل میٹل ڈشز (AttofluorTM، Thermofisher) کی موثر ہیٹنگ کا مظاہرہ دو گھریلو حرارتی عناصر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: ایک ڈھکن اور ایک اسٹیج (PCR مشین سے متاثر کنفیگریشن)۔ اس ایسوسی ایشن کے نتیجے میں یکساں مائع درجہ حرارت پیدا ہوتا ہے اور ڈھکن کے نچلے حصے میں بخارات اور گاڑھا ہونے کو روکتا ہے۔ O-ring کا استعمال ماحول کے ساتھ گیس کے تبادلے سے گریز کرتا ہے۔ یہ HTM، جسے سلفوسکوپ کہا جاتا ہے، 75°C27 پر سلفولوبس ایسڈوکالڈیریس کی تصویر بنانے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔
ان تمام سسٹمز کی ایک تسلیم شدہ حد ہوا کے مقاصد کے استعمال پر پابندی تھی، کسی بھی تیل کا ڈوبنا اتنے زیادہ درجہ حرارت کے لیے اور> 1-ملی میٹر موٹے شفاف نمونوں کے ذریعے امیجنگ کے لیے موزوں نہیں تھا۔ ان تمام سسٹمز کی ایک تسلیم شدہ حد ہوا کے مقاصد کے استعمال پر پابندی تھی، کسی بھی تیل کا ڈوبنا اتنے زیادہ درجہ حرارت کے لیے اور> 1-ملی میٹر موٹے شفاف نمونوں کے ذریعے امیجنگ کے لیے موزوں نہیں تھا۔ Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколькольку в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 ان تمام سسٹمز کی ایک تسلیم شدہ کمی ہوا کے مقاصد کے استعمال کی حد تھی، کیونکہ تیل کا کوئی بھی ڈوبنا اتنے زیادہ درجہ حرارت کے لیے موزوں نہیں تھا اور شفاف نمونے> 1 ملی میٹر موٹی کے ذریعے تصور کرنے کے لیے۔所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样都不镜厚的透明样品成像. ان تمام نظاموں کی ایک تسلیم شدہ حد ہوا میں داخل ہونے والے آئینے کے استعمال کی حد ہے، کیونکہ کسی بھی تیل کا ڈوبنا شفاف نمونے> 1 ملی میٹر موٹا اتنے زیادہ درجہ حرارت پر امیجنگ کے لیے موزوں نہیں ہے۔ Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любовмоер сло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. ان تمام سسٹمز کی ایک تسلیم شدہ خرابی ایئر لینسز کا محدود استعمال ہے، کسی بھی تیل کا ڈوبنا اس طرح کے اعلی درجہ حرارت اور شفاف نمونے> 1 ملی میٹر موٹی کے ذریعے تصور کے لیے موزوں نہیں ہے۔ابھی حال ہی میں، اس حد کو چارلس-اورزگ ایٹ ال نے ہٹا دیا تھا۔ 28، جس نے ایک ایسا آلہ تیار کیا جو دلچسپی کے نظام کے ارد گرد حرارت فراہم نہیں کرتا، بلکہ خود کور گلاس کے اندر، ITO (انڈیم ٹن آکسائیڈ) سے بنے ریزسٹر کی ایک پتلی شفاف تہہ سے ڈھکا ہوا ہے۔ شفاف تہہ سے برقی رو گزر کر ڈھکن کو 75 ° C تک گرم کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، مصنف کو عینک کو مقصد کے لیے گرم کرنا چاہیے، لیکن 65 °C سے زیادہ نہیں، تاکہ اسے نقصان نہ پہنچے۔
ان کاموں سے پتہ چلتا ہے کہ موثر اعلی درجہ حرارت آپٹیکل مائکروسکوپی کی ترقی کو وسیع پیمانے پر اپنایا نہیں گیا ہے، اکثر گھریلو سازوسامان کی ضرورت ہوتی ہے، اور اکثر مقامی ریزولوشن کی قیمت پر حاصل کیا جاتا ہے، جو کہ ایک سنگین نقصان ہے کیونکہ تھرموفیلک مائکروجنزم چند ایک سے زیادہ نہیں ہوتے ہیں۔ مائکرو میٹر حرارتی حجم میں کمی HTM کے تین موروثی مسائل کو حل کرنے کی کلید ہے: خراب مقامی ریزولیوشن، نظام کے گرم ہونے پر زیادہ تھرمل جڑنا، اور انتہائی درجہ حرارت پر ارد گرد کے عناصر (ڈوبنے والا تیل، معروضی لینس... یا صارف کے ہاتھ) کا نقصان دہ گرم ہونا۔ )۔
اس مقالے میں، ہم تھرموفائل مشاہدے کے لیے ایک HTM متعارف کراتے ہیں جو مزاحمتی حرارت پر مبنی نہیں ہے۔ اس کے بجائے، ہم نے روشنی کو جذب کرنے والے سبسٹریٹ کی لیزر شعاع ریزی کے ذریعے خوردبین کے نقطہ نظر کے ایک محدود علاقے میں مقامی حرارت حاصل کی۔ درجہ حرارت کی تقسیم کو مقداری فیز مائکروسکوپی (QPM) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ اس طریقہ کار کی تاثیر Geobacillus stearothermophilus، ایک متحرک تھرموفیلک بیکٹیریم سے ظاہر ہوتی ہے جو تقریباً 65°C پر دوبارہ پیدا ہوتا ہے اور اس کا دوگنا وقت کم ہوتا ہے (تقریباً 20 منٹ)، اور سلفولوبس شیباٹی، ایک ہائپر تھرموفیلس جو بہتر طور پر بڑھتا ہے (80°C) وضاحت کرنے کے لئے. عام نقل کی شرح اور تیراکی کو درجہ حرارت کے کام کے طور پر دیکھا گیا۔ یہ لیزر ایچ ٹی ایم (LA-HTM) کور سلپ کی موٹائی یا مقصد کی نوعیت (ہوا یا تیل کے وسرجن) سے محدود نہیں ہے۔ یہ مارکیٹ میں کسی بھی ہائی ریزولوشن لینس کو استعمال کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ یہ تھرمل جڑتا کی وجہ سے سست حرارت کا شکار بھی نہیں ہوتا ہے (ملی سیکنڈ کے پیمانے پر فوری حرارت حاصل کرتا ہے) اور صرف تجارتی طور پر دستیاب اجزاء استعمال کرتا ہے۔ صرف نئے حفاظتی خدشات آلہ کے اندر اور ممکنہ طور پر آنکھوں کے ذریعے طاقتور لیزر بیم (عام طور پر 100 میگاواٹ تک) کی موجودگی سے متعلق ہیں، جن کے لیے حفاظتی چشموں کی ضرورت ہوتی ہے۔
LA-HTM کا اصول یہ ہے کہ لیزر کا استعمال مقامی طور پر نمونے کو خوردبین کے نظارے کے میدان میں گرم کرنے کے لیے کیا جائے (تصویر 1a)۔ ایسا کرنے کے لیے، نمونہ روشنی کو جذب کرنے والا ہونا چاہیے۔ ایک معقول لیزر پاور (100 میگاواٹ سے کم) استعمال کرنے کے لیے، ہم نے مائع میڈیم کے ذریعے روشنی کے جذب پر انحصار نہیں کیا، لیکن مصنوعی طور پر سبسٹریٹ کو سونے کے نینو پارٹیکلز (تصویر 1c) کے ساتھ مل کر نمونے کے جذب کو بڑھایا۔ سونے کے نینو پارٹیکلز کو روشنی کے ساتھ گرم کرنا تھرمل پلازمونکس کے شعبے کے لیے بنیادی اہمیت کا حامل ہے، بائیو میڈیسن، نینو کیمسٹری یا سورج کی روشنی کی کٹائی 29,30,31 میں متوقع ایپلی کیشنز کے ساتھ۔ پچھلے کچھ سالوں میں، ہم نے اس LA-HTM کو طبیعیات، کیمسٹری اور حیاتیات میں تھرمل پلازما ایپلی کیشنز سے متعلق کئی مطالعات میں استعمال کیا ہے۔ اس طریقہ کار کے ساتھ سب سے بڑی مشکل آخری درجہ حرارت کی پروفائل کو ظاہر کرنے میں ہے، کیونکہ بلند درجہ حرارت نمونے کے اندر ایک مائیکرو اسکیل علاقے تک محدود ہے۔ ہم نے دکھایا ہے کہ درجہ حرارت کی نقشہ سازی کو چار طول موج کے ٹرانسورس شیئر انٹرفیرومیٹر کے ساتھ حاصل کیا جا سکتا ہے، ایک سادہ، اعلی ریزولوشن، اور مقداری فیز مائیکروسکوپی کا انتہائی حساس طریقہ جس کی بنیاد دو جہتی پھیلاؤ گریٹنگز (جسے کراس گریٹنگ بھی کہا جاتا ہے) کے استعمال پر مبنی ہے۔ 33,34,35,36۔ کراس گریٹنگ ویو فرنٹ مائیکروسکوپی (CGM) پر مبنی اس تھرمل مائکروسکوپی تکنیک کی وشوسنییتا کو پچھلی دہائی میں شائع ہونے والے ایک درجن مقالوں میں 37,38,39,40,41,42,43 میں ظاہر کیا گیا ہے۔
متوازی لیزر ہیٹنگ، شکل دینے اور درجہ حرارت خوردبین کی تنصیب کی اسکیم۔ b نمونہ جیومیٹری ایک AttofluorTM چیمبر پر مشتمل ہے جس میں سونے کے نینو پارٹیکلز کے ساتھ لیپت ایک کور سلپ ہے۔ c نمونے کو قریب سے دیکھیں (پیمانہ نہ کریں)۔ d یکساں لیزر بیم پروفائل کی نمائندگی کرتا ہے اور (e) سونے کے نینو پارٹیکلز کے نمونے والے جہاز پر بعد میں درجہ حرارت کی نقلی تقسیم۔ f ایک اینولر لیزر بیم پروفائل ہے جو یکساں درجہ حرارت پیدا کرنے کے لیے موزوں ہے جیسا کہ (g) میں دکھایا گیا درجہ حرارت کی تقسیم کے نتیجے میں دکھایا گیا ہے۔ اسکیل بار: 30 µm۔
خاص طور پر، ہم نے حال ہی میں LA-HTM اور CGM کے ساتھ ممالیہ خلیوں کی حرارت حاصل کی اور 37-42 ° C کی حد میں سیلولر ہیٹ شاک ردعمل کو ٹریک کیا، اس تکنیک کے واحد زندہ سیل امیجنگ پر لاگو ہونے کا مظاہرہ کیا۔ تاہم، اعلی درجہ حرارت پر مائکروجنزموں کے مطالعہ کے لیے LA-HTM کا اطلاق غیر واضح نہیں ہے، کیونکہ اس میں ممالیہ کے خلیوں کے مقابلے میں زیادہ احتیاط کی ضرورت ہوتی ہے: سب سے پہلے، درمیانے درجے کے نچلے حصے کو دسیوں ڈگری (بجائے چند ڈگریوں کے) گرم کرنے سے ایک مضبوط عمودی درجہ حرارت کے میلان تک۔ سیال کنویکشن 44 بنا سکتا ہے جو کہ اگر سبسٹریٹ کے ساتھ مضبوطی سے منسلک نہ ہو تو ناپسندیدہ حرکت اور بیکٹیریا کے اختلاط کا سبب بن سکتا ہے۔ مائع پرت کی موٹائی کو کم کرکے اس کنویکشن کو ختم کیا جاسکتا ہے۔ اس مقصد کے لیے، ذیل میں پیش کیے گئے تمام تجربات میں، بیکٹیریل سسپنشنز کو دھاتی کپ (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c) کے اندر تقریباً 15 µm موٹی دو کور سلپس کے درمیان رکھا گیا تھا۔ اصولی طور پر، اگر مائع کی موٹائی ہیٹنگ لیزر کے شہتیر کے سائز سے چھوٹی ہو تو کنویکشن سے بچا جا سکتا ہے۔ دوم، اتنی محدود جیومیٹری میں کام کرنا ایروبک جانداروں کا دم گھٹ سکتا ہے (دیکھیں تصویر S2)۔ اس مسئلے سے بچا جا سکتا ہے ایسے سبسٹریٹ کا استعمال کرتے ہوئے جو آکسیجن (یا کوئی دوسری اہم گیس) کے لیے قابل رسائی ہو، کور سلپ کے اندر پھنسے ہوئے ہوا کے بلبلوں کو چھوڑ کر، یا اوپری کور سلپ میں سوراخ کر کے (تصویر S1 دیکھیں) 45۔ اس مطالعے میں، ہم نے مؤخر الذکر حل (اعداد و شمار 1b اور S1) کا انتخاب کیا۔ آخر میں، لیزر ہیٹنگ درجہ حرارت کی یکساں تقسیم فراہم نہیں کرتی ہے۔ یہاں تک کہ لیزر بیم (تصویر 1 ڈی) کی اسی شدت پر، درجہ حرارت کی تقسیم یکساں نہیں ہے، بلکہ تھرمل بازی (تصویر 1e) کی وجہ سے گاوسی تقسیم سے مشابہت رکھتی ہے۔ جب مقصد حیاتیاتی نظاموں کا مطالعہ کرنے کے لیے نقطہ نظر کے میدان میں درست درجہ حرارت قائم کرنا ہوتا ہے، تو ناہموار پروفائلز مثالی نہیں ہوتے ہیں اور بیکٹیریا کی تھرموفوریٹک حرکت کا باعث بھی بن سکتے ہیں اگر وہ سبسٹریٹ پر عمل نہ کریں (تصویر S3، S4 دیکھیں)39۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے ایک مخصوص ہندسی علاقے کے اندر درجہ حرارت کی بالکل یکساں تقسیم حاصل کرنے کے لیے نمونے کے جہاز میں انگوٹھی کی شکل (تصویر 1f) کے مطابق انفراریڈ لیزر بیم کی شکل دینے کے لیے ایک مقامی روشنی ماڈیولیٹر (SLM) کا استعمال کیا، تھرمل پھیلاؤ کے باوجود (تصویر 1d) 39 , 42 , 46 . درمیانے درجے کے بخارات سے بچنے کے لیے دھاتی ڈش (Figure 1b) پر ایک اوپر کا احاطہ رکھیں اور کم از کم کچھ دنوں تک مشاہدہ کریں۔ چونکہ اس ٹاپ کور سلپ کو سیل نہیں کیا گیا ہے، اگر ضرورت ہو تو کسی بھی وقت اضافی میڈیم آسانی سے شامل کیا جا سکتا ہے۔
یہ واضح کرنے کے لیے کہ LA-HTM کس طرح کام کرتا ہے اور تھرمو فیلک تحقیق میں اس کے قابل اطلاق ہونے کا مظاہرہ کرتا ہے، ہم نے ایروبک بیکٹیریا جیوباکیلس سٹیروتھرموفیلس کا مطالعہ کیا، جس کا زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تقریباً 60-65°C ہے۔ اس جراثیم میں فلاجیلا اور تیرنے کی صلاحیت بھی ہوتی ہے، جو عام سیلولر سرگرمی کا ایک اور اشارہ فراہم کرتی ہے۔
نمونے (تصویر 1b) کو 60 ° C پر ایک گھنٹے کے لیے پہلے سے انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر LA-HTM سیمپل ہولڈر میں رکھا گیا۔ یہ پری انکیوبیشن اختیاری ہے، لیکن پھر بھی مفید ہے، دو وجوہات کی بناء پر: پہلی، جب لیزر آن کیا جاتا ہے، تو یہ خلیات کو فوری طور پر بڑھنے اور تقسیم کرنے کا سبب بنتا ہے (اضافی مواد میں فلم M1 دیکھیں)۔ پری انکیوبیشن کے بغیر، بیکٹیریا کی نشوونما میں عام طور پر تقریباً 40 منٹ کی تاخیر ہوتی ہے جب ہر بار نمونے پر دیکھنے کے نئے علاقے کو گرم کیا جاتا ہے۔ دوسرا، 1 گھنٹہ پری انکیوبیشن نے بیکٹیریا کو کور سلپ میں چپکنے کو فروغ دیا، لیزر آن ہونے پر خلیات کو تھرموفورسس کی وجہ سے منظر کے میدان سے باہر نکلنے سے روکا (ضمنی مواد میں فلم M2 دیکھیں)۔ تھرموفورسس درجہ حرارت کے میلان کے ساتھ ذرات یا مالیکیولز کی حرکت ہے، عام طور پر گرم سے ٹھنڈے تک، اور بیکٹیریا بھی اس سے مستثنیٰ نہیں ہیں43,47۔ لیزر بیم کی شکل دینے اور فلیٹ درجہ حرارت کی تقسیم کو حاصل کرنے کے لیے SLM کا استعمال کرتے ہوئے یہ ناپسندیدہ اثر کسی مخصوص علاقے پر ختم ہو جاتا ہے۔
انجیر پر۔ شکل 2 درجہ حرارت کی تقسیم کو ظاہر کرتا ہے جس کی پیمائش CGM کے ذریعے حاصل کی گئی شیشے کے سبسٹریٹ کو گولڈ نینو پارٹیکلز کے ساتھ کنڈلی لیزر بیم (تصویر 1f) سے شعاع بنا کر حاصل کی گئی ہے۔ لیزر بیم سے ڈھکے ہوئے پورے علاقے میں درجہ حرارت کی فلیٹ تقسیم دیکھی گئی۔ اس زون کو 65 ° C پر سیٹ کیا گیا تھا جو کہ ترقی کا بہترین درجہ حرارت ہے۔ اس خطے سے باہر، درجہ حرارت کا منحنی خطوط قدرتی طور پر \(1/r\) (جہاں \(r\) ریڈیل کوآرڈینیٹ ہے) پر آتا ہے۔
CGM پیمائش کا درجہ حرارت کا نقشہ جو گولڈ نینو پارٹیکلز کی ایک تہہ کو گولڈ ایریا پر فلیٹ ٹمپریچر پروفائل حاصل کرنے کے لیے اینولر لیزر بیم کے ذریعے حاصل کیا گیا ہے۔ b درجہ حرارت کے نقشے کا آئسوتھرم (a)۔ لیزر بیم کا سموچ سرمئی نقطے والے دائرے سے ظاہر ہوتا ہے۔ تجربہ دو بار دہرایا گیا (دیکھیں ضمنی مواد، شکل S4)۔
LA-HTM کا استعمال کرتے ہوئے بیکٹیریل خلیوں کی عملداری کو کئی گھنٹوں تک مانیٹر کیا گیا۔ انجیر پر۔ 3 3 گھنٹے 20 منٹ کی فلم (مووی M3، ضمنی معلومات) سے لی گئی چار تصاویر کے لیے وقت کا وقفہ دکھاتا ہے۔ بیکٹیریا کو لیزر کے ذریعہ بیان کردہ سرکلر علاقے کے اندر فعال طور پر پھیلتے ہوئے دیکھا گیا جہاں درجہ حرارت زیادہ سے زیادہ تھا، 65 ° C کے قریب۔ اس کے برعکس، سیل کی نشوونما میں نمایاں کمی واقع ہوئی جب درجہ حرارت 10 سیکنڈ کے لیے 50 ° C سے نیچے گر گیا۔
مختلف اوقات میں لیزر ہیٹنگ کے بعد بڑھنے والے جی سٹیروتھرموفیلس بیکٹیریا کی آپٹیکل گہرائی کی تصاویر، (a) t = 0 منٹ، (b) 1 h 10 منٹ، (c) 2 h 20 منٹ، (d) 3 h 20 منٹ، میں سے 200 ایک منٹ کی فلم سے نکالا گیا (ضمنی معلومات میں فراہم کردہ M3 فلم) متعلقہ درجہ حرارت کے نقشے پر سپرمپوزڈ۔ لیزر وقت پر آن ہوتا ہے \(t=0\)۔ شدت کی تصویر میں آئستھرم شامل کیے گئے ہیں۔
سیل کی نشوونما اور درجہ حرارت پر اس کے انحصار کو مزید درست کرنے کے لیے، ہم نے مووی M3 فیلڈ آف ویو (تصویر 4) میں ابتدائی طور پر الگ تھلگ بیکٹیریا کی مختلف کالونیوں کے بائیو ماس میں اضافے کی پیمائش کی۔ منی کالونی تشکیل دینے والے یونٹ (mCFU) کی تشکیل کے آغاز پر منتخب کردہ پیرنٹ بیکٹیریا کو شکل S6 میں دکھایا گیا ہے۔ خشک بڑے پیمانے پر پیمائش ایک CGM 48 کیمرے کے ساتھ کی گئی تھی جو درجہ حرارت کی تقسیم کو نقشہ بنانے کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ خشک وزن اور درجہ حرارت کی پیمائش کرنے کے لئے CGM کی صلاحیت LA-HTM کی طاقت ہے۔ جیسا کہ توقع کی جاتی ہے، زیادہ درجہ حرارت بیکٹیریا کی تیزی سے نشوونما کا سبب بنتا ہے (تصویر 4a)۔ جیسا کہ تصویر 4b میں سیمی لاگ پلاٹ میں دکھایا گیا ہے، تمام درجہ حرارت پر نمو ایکسپونینشل نمو کے بعد ہوتی ہے، جہاں ڈیٹا ایکسپونیشنل فنکشن کا استعمال کرتا ہے \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}، جہاں \(\tau {{{{\rm{log }}}}}}2\) – جنریشن ٹائم (یا دوگنا وقت)، \( g =1/ \tau\) - شرح نمو (فی یونٹ وقت میں تقسیم کی تعداد)۔ انجیر پر۔ 4c درجہ حرارت کے کام کے طور پر متعلقہ شرح نمو اور جنریشن کا وقت دکھاتا ہے۔ تیزی سے بڑھنے والے ایم سی ایف یو کی خصوصیت دو گھنٹے کے بعد نشوونما کی سنترپتی سے ہوتی ہے، زیادہ بیکٹیریا کی کثافت کی وجہ سے متوقع رویہ (کلاسیکی مائع ثقافتوں میں اسٹیشنری مرحلے کی طرح)۔ عمومی شکل \(g\left(T\right)\) (تصویر 4c) G. stearothermophilus کے لیے متوقع دو فیز وکر سے مساوی ہے جس کی شرح نمو 60-65°C کے قریب ہے۔ کارڈنل ماڈل (Figure S5)49 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کو میچ کریں جہاں \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}}} ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2؛ 40 ± 4؛ 65 ± 1.6؛ 67 ± 3) °C، جو ادب میں بیان کردہ دیگر اقدار سے اچھی طرح متفق ہے49۔ اگرچہ درجہ حرارت پر منحصر پیرامیٹرز دوبارہ پیدا کرنے کے قابل ہیں، \({G}_{0}\) کی زیادہ سے زیادہ شرح نمو ایک تجربے سے دوسرے میں مختلف ہو سکتی ہے (اعداد و شمار S7-S9 اور فلم M4 دیکھیں)۔ درجہ حرارت کی فٹنگ کے پیرامیٹرز کے برعکس، جو کہ عالمگیر ہونا چاہیے، زیادہ سے زیادہ شرح نمو کا انحصار مشاہدہ شدہ مائکرو اسکیل جیومیٹری کے اندر درمیانے درجے کی خصوصیات (غذائی اجزاء کی دستیابی، آکسیجن کا ارتکاز) پر ہوتا ہے۔
مختلف درجہ حرارت پر مائکروبیل نمو۔ mCFU: چھوٹے کالونی بنانے والے یونٹ۔ درجہ حرارت کے میلان (مووی M3) میں بڑھتے ہوئے ایک بیکٹیریم کی ویڈیو سے حاصل کردہ ڈیٹا۔ b اسی طرح (a)، نیم لوگارتھمک پیمانہ۔ c شرح نمو\(\tau\) اور جنریشن ٹائم\(g\) لکیری ریگریشن (b) سے شمار کیا جاتا ہے۔ افقی ایرر بارز: درجہ حرارت کی حد جس پر mCFUs نمو کے دوران منظر کے میدان میں پھیل گئے۔ عمودی ایرر بارز: لکیری ریگریشن معیاری خرابی۔
عام نشوونما کے علاوہ، بعض بیکٹیریا بعض اوقات لیزر ہیٹنگ کے دوران منظر میں آتے ہیں، جو کہ فلاجیلا والے بیکٹیریا کے لیے متوقع رویہ ہے۔ اضافی معلومات میں فلم M5 اس طرح کی تیراکی کی سرگرمیاں دکھاتی ہے۔ اس تجربے میں، درجہ حرارت کا میلان بنانے کے لیے یکساں لیزر ریڈی ایشن کا استعمال کیا گیا، جیسا کہ اعداد و شمار 1d، e اور S3 میں دکھایا گیا ہے۔ شکل 5 ایم 5 مووی سے منتخب کردہ دو تصویری سلسلے دکھاتا ہے جس میں دکھایا گیا ہے کہ ایک بیکٹیریا دشاتمک حرکت کا مظاہرہ کرتا ہے جبکہ باقی تمام بیکٹیریا بے حرکت رہتے ہیں۔
دو ٹائم فریم (a) اور (b) دو مختلف بیکٹیریا کی تیراکی کو دکھاتے ہیں جن پر نقطے والے دائرے ہیں۔ تصاویر کو M5 مووی (اضافی مواد کے طور پر فراہم کردہ) سے نکالا گیا تھا۔
G. stearothermophilus کے معاملے میں، بیکٹیریا کی فعال حرکت (تصویر 5) لیزر بیم کے آن ہونے کے چند سیکنڈ بعد شروع ہوئی۔ یہ مشاہدہ درجہ حرارت میں اضافے کے لیے اس تھرمو فیلک مائکروجنزم کے وقتی ردعمل پر زور دیتا ہے، جیسا کہ پہلے ہی مورا وغیرہ نے مشاہدہ کیا ہے۔ 24 LA-HTM کا استعمال کرتے ہوئے بیکٹیریل حرکت پذیری اور یہاں تک کہ تھرموٹیکسس کے موضوع کو مزید دریافت کیا جا سکتا ہے۔
مائکروبیل تیراکی کو جسمانی حرکات کی دوسری قسموں کے ساتھ الجھن میں نہیں ڈالنا چاہیے، یعنی (i) براؤنین حرکت، جو کہ کوئی متعین سمت کے بغیر افراتفری کی حرکت دکھائی دیتی ہے، (ii) کنویکشن 50 اور تھرموفورسس 43، جو درجہ حرارت کے ساتھ ساتھ حرکت کے باقاعدہ بہاؤ پر مشتمل ہوتی ہے۔ میلان
جی سٹیروتھرموفیلس دفاع کے طور پر منفی ماحولیاتی حالات کے سامنے آنے پر انتہائی مزاحم بیضوں (بیضوں کی تشکیل) پیدا کرنے کی صلاحیت کے لیے جانا جاتا ہے۔ جب ماحولیاتی حالات دوبارہ سازگار ہو جاتے ہیں، تو بیضے اگتے ہیں، زندہ خلیات بناتے ہیں اور دوبارہ ترقی شروع کر دیتے ہیں۔ اگرچہ یہ اسپورولیشن/انکرن کا عمل اچھی طرح سے جانا جاتا ہے، لیکن اس کا حقیقی وقت میں کبھی مشاہدہ نہیں کیا گیا۔ LA-HTM کا استعمال کرتے ہوئے، ہم یہاں G. stearothermophilus میں انکرن کے واقعات کے پہلے مشاہدے کی اطلاع دیتے ہیں۔
انجیر پر۔ 6a 13 spores کے CGM سیٹ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ آپٹیکل ڈیپتھ (OT) کی ٹائم لیپس امیجز دکھاتا ہے۔ جمع کرنے کے پورے وقت کے لیے (15 گھنٹے 6 منٹ، \(t=0\) - لیزر ہیٹنگ کا آغاز)، 13 میں سے 4 بیضہ اگے، لگاتار ٹائم پوائنٹس پر \(t=2\) h، \( 3\ ) h \(10 \)'، \(9\) h \(40\)' اور \(11\) h \(30\)'۔ اگرچہ ان واقعات میں سے صرف ایک ہی تصویر 6 میں دکھایا گیا ہے، لیکن ضمنی مواد میں M6 فلم میں 4 انکرن کے واقعات دیکھے جا سکتے ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ انکرن بے ترتیب دکھائی دیتا ہے: ماحولیاتی حالات میں یکساں تبدیلیوں کے باوجود تمام بیضہ انکرن نہیں ہوتے اور ایک ہی وقت میں انکرن نہیں ہوتے۔
ایک ٹائم لیپس جس میں 8 OT امیجز شامل ہیں (تیل کا ڈوبنا، 60x، 1.25 NA مقصد) اور (b) جی سٹیروتھرموفیلس ایگریگیٹس کا بایوماس ارتقاء۔ c (b) نمو کی شرح (ڈیشڈ لائن) کی لکیری کو نمایاں کرنے کے لیے نیم لاگ اسکیل پر تیار کیا گیا۔
انجیر پر۔ 6b،c ڈیٹا اکٹھا کرنے کی پوری مدت میں وقت کے فنکشن کے طور پر منظر کے میدان میں سیل کی آبادی کے بایوماس کو دکھاتا ہے۔ انجیر میں \(t=5\)h پر دیکھا گیا خشک ماس کا تیزی سے زوال۔ 6b، c، منظر کے میدان سے کچھ خلیوں کے باہر نکلنے کی وجہ سے۔ ان چار واقعات کی شرح نمو \(0.77\pm 0.1\) h-1 ہے۔ یہ قدر شکل 3. 3 اور 4 سے وابستہ شرح نمو سے زیادہ ہے، جہاں خلیات عام طور پر بڑھتے ہیں۔ spores سے G. stearothermophilus کی بڑھتی ہوئی شرح نمو کی وجہ واضح نہیں ہے، لیکن یہ پیمائشیں LA-HTM کی دلچسپی کو اجاگر کرتی ہیں اور خلیے کی زندگی کی حرکیات کے بارے میں مزید جاننے کے لیے سنگل سیل لیول (یا سنگل mCFU لیول پر) کام کرتی ہیں۔ .
LA-HTM کی استعداد اور اعلی درجہ حرارت پر اس کی کارکردگی کو مزید ظاہر کرنے کے لیے، ہم نے سلفولوبس شیباٹی کی نشوونما کا جائزہ لیا، ایک ہائپر تھرموفیلک ایسڈوفیلک آثار قدیمہ جس کا زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت 80°C51 ہے۔ G. stearothermophilus کے مقابلے میں، ان آثار قدیمہ کی شکل بھی بہت مختلف ہوتی ہے، جو لمبے لمبے چھڑیوں (بیسیلی) کے بجائے 1 مائکرون کے دائرے (cocci) سے مشابہت رکھتی ہے۔
شکل 7a S. shibatae mCFU کی ترتیب وار آپٹیکل گہرائی کی تصاویر پر مشتمل ہے جو CGM کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئی ہے (ضمنی مواد میں M7 فیچر فلم دیکھیں)۔ یہ mCFU تقریباً 73 ° C پر بڑھتا ہے، زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت 80 ° C سے کم، لیکن فعال نشوونما کے لیے درجہ حرارت کی حد کے اندر۔ ہم نے متعدد فِشن واقعات کا مشاہدہ کیا جس نے کچھ گھنٹوں کے بعد mCFUs کو آثار قدیمہ کے مائیکرو گرافس کی طرح دیکھا۔ ان او ٹی امیجز سے، ایم سی ایف یو بایوماس کو وقت کے ساتھ ناپا گیا اور شکل 7b میں پیش کیا گیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ S. shibatae mCFUs نے G. stearothermophilus mCFUs کے ساتھ ظاہری نمو کے بجائے لکیری نمو دکھائی۔ خلیوں کی نشوونما کی شرح کی نوعیت کے بارے میں ایک طویل بحث 52 ہے: جب کہ کچھ مطالعات میں جرثوموں کی شرح نمو کی اطلاع دی گئی ہے جو ان کے سائز کے متناسب ہیں (قطعی نمو)، دیگر ایک مستقل شرح (لکیری یا دو لکیری نمو) دکھاتے ہیں۔ جیسا کہ Tzur et al.53 کی طرف سے وضاحت کی گئی ہے، کفایتی اور (bi) لکیری نمو کے درمیان فرق کرنے کے لیے بایوماس پیمائش میں <6% کی درستگی کی ضرورت ہوتی ہے، جو کہ زیادہ تر QPM تکنیکوں کی پہنچ سے باہر ہے، یہاں تک کہ انٹرفیومیٹری بھی شامل ہے۔ جیسا کہ Tzur et al.53 کی طرف سے وضاحت کی گئی ہے، کفایتی اور (bi) لکیری نمو کے درمیان فرق کرنے کے لیے بایوماس پیمائش میں <6% کی درستگی کی ضرورت ہوتی ہے، جو کہ زیادہ تر QPM تکنیکوں کی پہنچ سے باہر ہے، یہاں تک کہ انٹرفیومیٹری بھی شامل ہے۔ Как объяснили Цур и др.53، различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях бысмерениях бисмерениях бысбодости کیو پی ایم کے لیے انتخاب کریں جیسا کہ Zur et al.53 کی طرف سے وضاحت کی گئی ہے، کفایتی اور (bi) لکیری نمو کے درمیان فرق کرنے کے لیے بایوماس کی پیمائش میں <6% درستگی کی ضرورت ہوتی ہے، جو کہ زیادہ تر QPM طریقوں کے لیے ناقابل رسائی ہے، حتیٰ کہ انٹرفیومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے بھی۔جیسا کہ Zur et al نے وضاحت کی ہے۔ 53، کفایتی اور (دو) لکیری نمو کے درمیان فرق کرنے کے لیے بایوماس پیمائش میں 6% سے کم درستگی کی ضرورت ہوتی ہے، جو کہ زیادہ تر QPM طریقوں کے لیے ناقابل حصول ہے، یہاں تک کہ جب انٹرفیومیٹری استعمال کی جاتی ہے۔ CGM بایوماس پیمائش36,48 میں ذیلی pg درستگی کے ساتھ اس درستگی کو حاصل کرتا ہے۔
ایک ٹائم لیپس جس میں 6 OT امیجز شامل ہیں (تیل کا ڈوبنا، 60x، NA مقصد 1.25) اور (b) CGM کے ساتھ ماپا مائیکرو-CFU بائیو ماس ارتقاء۔ مزید معلومات کے لیے فلم M7 دیکھیں۔
S. shibatae کی بالکل لکیری نمو غیر متوقع تھی اور ابھی تک اس کی اطلاع نہیں ملی ہے۔ تاہم، تیزی سے بڑھنے کی توقع ہے، کم از کم اس لیے کہ وقت گزرنے کے ساتھ ساتھ، 2، 4، 8، 16 … خلیات کی متعدد تقسیم ضرور ہوتی ہیں۔ ہم نے قیاس کیا کہ لکیری نمو سیل کی روک تھام کی وجہ سے ہو سکتی ہے جس کی وجہ سیل کی گھنے پیکنگ ہے، بالکل اسی طرح جیسے سیل کی افزائش سست ہو جاتی ہے اور آخر کار غیر فعال حالت میں پہنچ جاتی ہے جب سیل کی کثافت بہت زیادہ ہوتی ہے۔
ہم باری باری دلچسپی کے مندرجہ ذیل پانچ نکات پر بحث کرتے ہوئے نتیجہ اخذ کرتے ہیں: حرارتی حجم میں کمی، تھرمل جڑتا میں کمی، سونے کے نینو پارٹیکلز میں دلچسپی، مقداری مرحلے کی مائیکروسکوپی میں دلچسپی، اور درجہ حرارت کی ممکنہ حد جس میں LA-HTM استعمال کیا جا سکتا ہے۔
مزاحمتی حرارتی نظام کے مقابلے میں، ایچ ٹی ایم کی ترقی کے لیے استعمال ہونے والی لیزر ہیٹنگ کئی فوائد پیش کرتی ہے، جن کی ہم اس تحقیق میں مثال دیتے ہیں۔ خاص طور پر، خوردبین کے نقطہ نظر کے میدان میں مائع میڈیا میں، حرارتی حجم چند (10 μm) 3 حجم کے اندر رکھا جاتا ہے. اس طرح، صرف مشاہدہ شدہ جرثومے ہی فعال ہوتے ہیں، جب کہ دیگر بیکٹیریا غیر فعال ہوتے ہیں اور نمونے کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے - جب بھی نئے درجہ حرارت کو چیک کرنے کی ضرورت ہو تو نمونے کو تبدیل کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔ اس کے علاوہ، مائیکرو اسکیل ہیٹنگ درجہ حرارت کی ایک بڑی رینج کا براہ راست معائنہ کرنے کی اجازت دیتی ہے: شکل 4c 3 گھنٹے کی فلم (Movie M3) سے حاصل کی گئی تھی، جس کے لیے عام طور پر کئی نمونوں کی تیاری اور جانچ کی ضرورت ہوتی ہے – زیر مطالعہ ہر نمونے کے لیے ایک۔ y وہ درجہ حرارت ہے جو تجربے میں دنوں کی تعداد کو ظاہر کرتا ہے۔ گرم حجم کو کم کرنے سے مائیکروسکوپ کے ارد گرد کے تمام آپٹیکل اجزاء، خاص طور پر معروضی لینس کو کمرے کے درجہ حرارت پر رکھا جاتا ہے، جو کہ اب تک کمیونٹی کو درپیش ایک بڑا مسئلہ رہا ہے۔ LA-HTM کسی بھی لینس کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے، بشمول آئل انسرشن لینز، اور یہ کمرے کے درجہ حرارت پر رہے گا یہاں تک کہ منظر کے میدان میں انتہائی درجہ حرارت کے باوجود۔ لیزر ہیٹنگ کے طریقہ کار کی بنیادی حد جس کی ہم نے اس تحقیق میں اطلاع دی ہے وہ یہ ہے کہ وہ خلیے جو نہیں لگاتے یا تیرتے ہیں وہ دیکھنے کے میدان سے دور اور مطالعہ کرنا مشکل ہو سکتا ہے۔ چند سو مائیکرون سے زیادہ درجہ حرارت میں اضافے کو حاصل کرنے کے لیے کم میگنیفیکیشن لینز کا استعمال کرنا ایک حل ہو سکتا ہے۔ یہ احتیاط مقامی ریزولوشن میں کمی کے ساتھ ہے، لیکن اگر مقصد مائکروجنزموں کی نقل و حرکت کا مطالعہ کرنا ہے تو، اعلی مقامی ریزولوشن کی ضرورت نہیں ہے۔
سسٹم کو گرم کرنے (اور ٹھنڈا کرنے) کے لیے ٹائم پیمانہ \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}}}}}}} {{{\mbox{D}}}}\) اس کے سائز پر منحصر ہے، قانون کے مطابق \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), جہاں \ (L\ ) حرارت کے منبع کی خصوصیت کا سائز ہے (ہمارے مطالعہ میں لیزر بیم کا قطر \(L\ تقریباً 100\) μm ہے)، \(D\) ماحول کی حرارتی پھیلاؤ ہے (ہمارے اوسط میں کیس، گلاس اور پانی کے پھیلاؤ کی شرح\(D\ تقریباً 2\ گنا {10}^{-7}\) m2/s) اس لیے، اس مطالعے میں، 50 ms کے آرڈر کے وقت کے جوابات، یعنی نیم فوری طور پر۔ درجہ حرارت میں تبدیلی کی توقع کی جا سکتی ہے کہ درجہ حرارت میں اضافے کا یہ فوری قیام نہ صرف تجربے کی مدت کو کم کرتا ہے بلکہ درجہ حرارت کے اثرات کے کسی بھی متحرک مطالعہ کے لیے درست وقت کی اجازت دیتا ہے۔
ہمارا مجوزہ طریقہ کسی بھی روشنی کو جذب کرنے والے سبسٹریٹ پر لاگو ہوتا ہے (مثال کے طور پر ITO کوٹنگ والے تجارتی نمونے)۔ تاہم، سونے کے نینو پارٹیکلز انفراریڈ میں زیادہ جذب اور مرئی رینج میں کم جذب فراہم کرنے کے قابل ہیں، جن کی بعد کی خصوصیات مرئی حد میں مؤثر نظری مشاہدے کے لیے دلچسپی رکھتی ہیں، خاص طور پر جب فلوروسینس کا استعمال کرتے ہیں۔ اس کے علاوہ، سونا حیاتیاتی مطابقت رکھتا ہے، کیمیائی طور پر غیر فعال، نظری کثافت کو 530 nm سے قریب کے انفراریڈ میں ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے، اور نمونے کی تیاری آسان اور اقتصادی ہے29۔
ٹرانسورس گریٹنگ ویو فرنٹ مائیکروسکوپی (سی جی ایم) نہ صرف مائیکرو اسکیل پر درجہ حرارت کی نقشہ سازی کی اجازت دیتی ہے بلکہ بائیو ماس کی نگرانی بھی کرتی ہے، جو اسے LA-HTM کے ساتھ مل کر خاص طور پر مفید (اگر ضروری نہ ہو) بناتی ہے۔ پچھلی دہائی کے دوران، دیگر درجہ حرارت کی مائیکروسکوپی تکنیکیں تیار کی گئی ہیں، خاص طور پر بائیو امیجنگ کے شعبے میں، اور ان میں سے زیادہ تر درجہ حرارت سے متعلق حساس فلوروسینٹ پروبس 54,55 کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے۔ تاہم، ان طریقوں پر تنقید کی گئی ہے اور کچھ رپورٹس میں خلیات کے اندر درجہ حرارت کی غیر حقیقی تبدیلیوں کی پیمائش کی گئی ہے، ممکنہ طور پر اس حقیقت کی وجہ سے کہ فلوروسینس درجہ حرارت کے علاوہ بہت سے عوامل پر منحصر ہے۔ اس کے علاوہ، زیادہ تر فلوروسینٹ تحقیقات اعلی درجہ حرارت پر غیر مستحکم ہوتی ہیں۔ لہذا، QPM اور خاص طور پر CGM آپٹیکل مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے اعلی درجہ حرارت پر زندگی کا مطالعہ کرنے کے لئے ایک مثالی درجہ حرارت مائکروسکوپی تکنیک کی نمائندگی کرتا ہے۔
S. shibatae کے مطالعے، جو 80 ° C پر بہترین طور پر رہتے ہیں، یہ ظاہر کرتے ہیں کہ LA-HTM کو ہائپر تھرمو فائلز کے مطالعہ کے لیے لاگو کیا جا سکتا ہے، نہ کہ سادہ تھرمو فائلز۔ اصولی طور پر، درجہ حرارت کی حد کی کوئی حد نہیں ہے جس تک LA-HTM کا استعمال کرتے ہوئے پہنچا جا سکتا ہے، اور یہاں تک کہ 100°C سے اوپر کے درجہ حرارت کو بھی بغیر ابلائے ہوا کے دباؤ پر پہنچا جا سکتا ہے، جیسا کہ ہمارے 38 کے گروپ نے ہوا میں ہائیڈرو تھرمل کیمسٹری ایپلی کیشنز میں ظاہر کیا ہے۔ پریشر A. گولڈ نینو پارٹیکلز 40 کو اسی طرح گرم کرنے کے لیے ایک لیزر استعمال کیا جاتا ہے۔ اس طرح، LA-HTM میں معیاری حالات (یعنی ماحولیاتی دباؤ کے تحت) معیاری ہائی ریزولیوشن آپٹیکل مائکروسکوپی کے ساتھ بے مثال ہائپر تھرموفیلس کا مشاہدہ کرنے کی صلاحیت ہے۔
تمام تجربات گھریلو مائیکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے، بشمول Köhler الیومینیشن (ایل ای ڈی، M625L3، Thorlabs، 700 میگاواٹ کے ساتھ)، دستی xy حرکت کے ساتھ نمونہ ہولڈر، مقاصد (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X, O150x, O150x, Olympus, 60x, 0.7 NA, air. ، UPLFLN60XOI)، CGM کیمرہ (QLSI کراس گریٹنگ، 39 µm پچ، Andor Zyla کیمرہ سینسر سے 0.87 mm) شدت اور ویو فرنٹ امیجنگ فراہم کرنے کے لیے، اور sCMOS کیمرہ (ORCA Flash 4.0 V3، 16-bit موڈ، تھیماتسو سے ریکارڈ کرنے کے لیے) اعداد و شمار کو شکل 5 میں دکھایا گیا ہے (بیکٹیریل سوئمنگ)۔ ڈیکروک بیم اسپلٹر ایک 749 nm برائٹ لائن ایج (سیمروک، FF749-SDi01) ہے۔ کیمرے کے سامنے والا فلٹر ایک 694 شارٹ پاس فلٹر ہے (FF02-694/SP-25، Semrock)۔ ٹائٹینیم سیفائر لیزر (لیزر ورڈی جی 10، 532 این ایم، 10 ڈبلیو، پمپڈ سونامی لیزر کیوٹی، تصویر 2-5 میں سپیکٹرا فزکس، مزید ملینیا لیزر، سپیکٹرا فزکس 10 ڈبلیو، پمپڈ میرا لیزر کیوٹی، کوہیرنٹ، F.2 کے لیے -5)۔ 6 اور 7) طول موج \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm پر سیٹ ہیں، جو سونے کے نینو پارٹیکلز کے پلازمون ریزوننس سپیکٹرم سے مساوی ہے۔ مقامی روشنی ماڈیولٹرز (1920 × 1152 پکسلز) Meadowlark Optics سے خریدے گئے تھے جیسا کہ لنک 39 میں بیان کیا گیا ہے۔
کراس گریٹنگ ویو فرنٹ مائیکروسکوپی (سی جی ایم) ایک آپٹیکل مائکروسکوپی تکنیک ہے جس کی بنیاد روایتی کیمرے کے سینسر سے ایک ملی میٹر کے فاصلے پر دو جہتی ڈفریکشن گریٹنگ (جسے کراس گریٹنگ بھی کہا جاتا ہے) کو ملایا جاتا ہے۔ ایک CGM کی سب سے عام مثال جسے ہم نے اس مطالعہ میں استعمال کیا ہے اسے چار طول موج کی ٹرانسورس شفٹ انٹرفیرومیٹر (QLSI) کہا جاتا ہے، جہاں کراس گریٹنگ ایک شدت/فیز چیکر بورڈ پیٹرن پر مشتمل ہوتی ہے جسے Primot et al نے متعارف کرایا اور پیٹنٹ کیا۔ 200034 میں۔ عمودی اور افقی گریٹنگ لائنیں سینسر پر گرڈ جیسے سائے بناتی ہیں، جس کی مسخ کو حقیقی وقت میں عددی طور پر پروسیس کیا جا سکتا ہے تاکہ واقعہ کی روشنی کی آپٹیکل ویو فرنٹ ڈسٹورشن (یا مساوی فیز پروفائل) حاصل کیا جا سکے۔ جب ایک خوردبین پر استعمال کیا جاتا ہے تو، ایک CGM کیمرہ نینو میٹر 36 کی ترتیب پر حساسیت کے ساتھ، تصویری شے کے نظری راستے کے فرق کو ظاہر کر سکتا ہے، جسے آپٹیکل ڈیپتھ (OT) بھی کہا جاتا ہے۔ کسی بھی CGM پیمائش میں، آپٹیکل اجزاء یا شہتیروں میں کسی بھی نقائص کو ختم کرنے کے لیے، ایک بنیادی حوالہ OT تصویر لینی چاہیے اور اس کے بعد کی کسی بھی تصویر سے منہا کی جانی چاہیے۔
درجہ حرارت کی مائکروسکوپی CGM کیمرے کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی جیسا کہ حوالہ میں بیان کیا گیا ہے۔ 32. مختصراً، مائع کو گرم کرنے سے اس کا اضطراری اشاریہ بدل جاتا ہے، جس سے ایک تھرمل لینس اثر پیدا ہوتا ہے جو واقعہ کی شہتیر کو بگاڑ دیتا ہے۔ اس ویو فرنٹ ڈسٹورشن کو CGM کے ذریعے ماپا جاتا ہے اور مائع میڈیم میں درجہ حرارت کی سہ جہتی تقسیم حاصل کرنے کے لیے ڈیکونولوشن الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے اس پر کارروائی کی جاتی ہے۔ اگر سونے کے نینو پارٹیکلز کو پورے نمونے میں یکساں طور پر تقسیم کیا جائے تو بہتر تصاویر بنانے کے لیے بیکٹیریا سے پاک علاقوں میں درجہ حرارت کی نقشہ سازی کی جا سکتی ہے، جو ہم بعض اوقات کرتے ہیں۔ حوالہ CGM امیج کو بغیر ہیٹنگ کیے (لیزر آف کے ساتھ) حاصل کیا گیا تھا اور بعد میں لیزر آن کے ساتھ تصویر میں اسی مقام پر حاصل کیا گیا تھا۔
خشک بڑے پیمانے پر پیمائش اسی CGM کیمرے کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی جاتی ہے جو درجہ حرارت کی تصویر کشی کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ بیکٹیریا کی موجودگی کی وجہ سے OT میں کسی بھی غیر ہم آہنگی کو اوسط کرنے کے ایک ذریعہ کے طور پر نمائش کے دوران نمونے کو تیزی سے x اور y میں منتقل کرکے CGM حوالہ جات کی تصاویر حاصل کی گئیں۔ بیکٹیریا کی او ٹی امیجز سے، ان کا بایوماس متلب کے گھریلو سیگمنٹیشن الگورتھم (سب سیکشن "عددی کوڈ" کو دیکھیں) کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ علاقوں پر تصاویر کے ایک جوڑ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا، ریف میں بیان کردہ طریقہ کار کے بعد۔ 48. مختصر میں، ہم رشتہ استعمال کرتے ہیں \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}y\), جہاں \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) آپٹیکل گہرائی کی تصویر ہے، \(m\) ہے خشک وزن اور \({{{{\rm{\alpha }}}}}\) ایک مستقل ہے۔ ہم نے \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg کا انتخاب کیا، جو زندہ خلیوں کے لیے ایک عام مستقل ہے۔
ایک کور سلپ 25 ملی میٹر قطر اور سونے کے نینو پارٹیکلز کے ساتھ 150 µm موٹی لیپت ایک AttofluorTM چیمبر (Thermofisher) میں رکھی گئی تھی جس میں سونے کے نینو پارٹیکلز کا سامنا تھا۔ جیوباسیلس سٹیروتھرموفیلس کو ہر دن تجربات سے پہلے ایل بی میڈیم (200 rpm، 60 ° C) میں راتوں رات پہلے سے تیار کیا گیا تھا۔ 0.3 سے 0.5 کی نظری کثافت (OD) کے ساتھ G. stearothermophilus کے سسپنشن کا 5 µl کا ایک قطرہ سونے کے نینو پارٹیکلز کے ساتھ کور سلپ پر رکھا گیا تھا۔ اس کے بعد، ایک گول کور سلپ 18 ملی میٹر قطر میں ایک سوراخ کے ساتھ مرکز میں 5 ملی میٹر قطر ڈراپ پر گرا دیا گیا، اور اسی نظری کثافت کے ساتھ بیکٹیریل سسپنشن کا 5 μl بار بار سوراخ کے مرکز میں لگایا گیا۔ کور سلپس پر کنویں ریف میں بیان کردہ طریقہ کار کے مطابق تیار کیے گئے تھے۔ 45 (مزید معلومات کے لیے ضمنی معلومات دیکھیں)۔ پھر کور سلپ میں 1 ملی لیٹر ایل بی میڈیم شامل کریں تاکہ مائع کی تہہ کو خشک ہونے سے بچایا جا سکے۔ آخری کور سلپ Attofluor™ چیمبر کے بند ڈھکن پر رکھی جاتی ہے تاکہ انکیوبیشن کے دوران میڈیم کے بخارات کو روکا جا سکے۔ انکرن کے تجربات کے لیے، ہم نے بیضہ جات کا استعمال کیا، جو روایتی تجربات کے بعد، بعض اوقات سب سے اوپر کا احاطہ کرتا ہے۔ اسی طرح کا طریقہ سلفولوبس شیباٹی حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ Thiobacillus serrata کی ابتدائی کاشت کے تین دن (200 rpm, 75°C) درمیانے درجے کے 182 (DSMZ) میں کئے گئے۔
سونے کے نینو پارٹیکلز کے نمونے مائیکلر بلاک کوپولیمر لتھوگرافی کے ذریعے تیار کیے گئے تھے۔ اس عمل کو باب میں تفصیل سے بیان کیا گیا ہے۔ 60. مختصراً، سونے کے آئنوں کو گھیرے ہوئے مائیکلز کوپولیمر کو HAuCl4 کے ساتھ ٹولین میں ملا کر ترکیب کیا گیا۔ پھر صاف شدہ کور سلپس کو محلول میں ڈبو دیا گیا اور سونے کے بیج حاصل کرنے کے لیے کم کرنے والے ایجنٹ کی موجودگی میں UV شعاع ریزی کے ساتھ علاج کیا گیا۔ آخر میں، سونے کے بیجوں کو KAuCl4 اور ایتھانولامین کے آبی محلول کے ساتھ 16 منٹ کے لیے کور سلپ سے رابطہ کرکے اگایا گیا، جس کے نتیجے میں قریب کے انفراریڈ میں غیر کروی سونے کے نینو پارٹیکلز کا نیم متواتر اور انتہائی یکساں انتظام ہوا۔
انٹرفیروگرامس کو او ٹی امیجز میں تبدیل کرنے کے لیے، ہم نے گھریلو الگورتھم استعمال کیا، جیسا کہ لنک میں تفصیل سے بتایا گیا ہے۔ 33 اور درج ذیل عوامی ذخیرہ میں متلاب پیکیج کے طور پر دستیاب ہے: https://github.com/baffou/CGMprocess۔ پیکج ریکارڈ شدہ انٹرفیروگرامس (بشمول حوالہ جات کی تصاویر) اور کیمرے کی صفوں کی دوری کی بنیاد پر شدت اور OT تصاویر کا حساب لگا سکتا ہے۔
درج ذیل درجہ حرارت کا پروفائل حاصل کرنے کے لیے SLM پر لاگو فیز پیٹرن کا حساب لگانے کے لیے، ہم نے پہلے سے تیار کردہ گھریلو الگورتھم 39,42 استعمال کیا جو درج ذیل عوامی ذخیرہ میں دستیاب ہے: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping۔ ان پٹ مطلوبہ درجہ حرارت کا فیلڈ ہے، جسے ڈیجیٹل طور پر یا مونوکروم bmp امیج کے ذریعے سیٹ کیا جا سکتا ہے۔
خلیوں کو تقسیم کرنے اور ان کے خشک وزن کی پیمائش کرنے کے لیے، ہم نے درج ذیل عوامی ذخیرے میں شائع ہونے والے اپنے Matlab الگورتھم کا استعمال کیا: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation۔ ہر تصویر پر، صارف کو دلچسپی کے بیکٹیریا یا mCFU پر کلک کرنا ہوگا، چھڑی کی حساسیت کو ایڈجسٹ کرنا ہوگا، اور انتخاب کی تصدیق کرنی ہوگی۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے منسلک نیچر ریسرچ رپورٹ کا خلاصہ دیکھیں۔
اس مطالعہ کے نتائج کی حمایت کرنے والا ڈیٹا متعلقہ مصنفین سے معقول درخواست پر دستیاب ہے۔
اس مطالعہ میں استعمال کردہ سورس کوڈ کی تفصیل طریقے سیکشن میں ہے، اور ڈیبگ ورژنز کو https://github.com/baffou/ سے درج ذیل ریپوزٹریز میں ڈاؤن لوڈ کیا جا سکتا ہے: SLM_temperatureShaping، CGMprocess، اور CGM_magicWandSegmentation۔
مہتا، آر، سنگھل، پی، سنگھ، ایچ، داملے، ڈی اور شرما، اے کے انسائٹ ان تھرمو فائلز اور ان کے وسیع اسپیکٹرم ایپلی کیشنز۔ مہتا، آر، سنگھل، پی، سنگھ، ایچ، داملے، ڈی اور شرما، اے کے انسائٹ ان تھرمو فائلز اور ان کے وسیع اسپیکٹرم ایپلی کیشنز۔مہتا، آر، سنگھل، پی، سنگھ، ایچ، داملے، ڈی اور شرما، اے کے تھرموفیلس کا جائزہ اور ان کا وسیع اطلاق۔ مہتا، آر، سنگھل، پی، سنگھ، ایچ، دملے، ڈی اور شرما، اے کے 深入了解嗜热菌及其广谱应用۔ مہتا، آر، سنگھل، پی، سنگھ، ایچ، دملے، ڈی اور شرما، اے کے۔مہتا آر، سنگھل پی، سنگھ ایچ، ڈملے ڈی اور شرما اے کے تھرمو فائلز کی گہری سمجھ اور ایپلی کیشنز کی ایک وسیع رینج۔3 بائیو ٹیکنالوجی 6، 81 (2016)۔